重组人CUZD1蛋白和抗体等相关研究工具的制备
CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，其表达是受到子宫和输卵管两 个关键生殖组织中雌激素的严格调控的。分析表明，在子宫和输卵管中，CUZD1 在 mRNA 水 平上表现出很强的时间、空间的特异性, 其表达位置仅限于子宫和输卵管的上皮细胞表面。 核苷酸序列分析表明 CUZD1 全长 cDNA 含有一个由 1821 个核酸编码的开放阅读框，该阅读 框可被翻译成 607 个氨基酸，包含一个单次跨膜区域以及一个短的胞内蛋白片段。最近的研 究表明 CUZD1 的抗血清能够抑制卵巢癌细胞的附着和增殖，此外在怀孕后期的子宫中或（和） 胰蛋白酶激活胰腺腺泡细胞中也可能起到重要作用。
现在市面上商业化的 CUZD1 的产品非常少，Cloud-Clone Crop.针对这一重要蛋白生产了 一系列可用于科研的蛋白、抗体和检测试剂盒产品提供给广大的科研人员。
首先通过抗原表位预测，功能结构域分析，mRNA 二级结构预测，重组蛋白可溶性预测 等多种分析方法，最终确定了用于重组表达的蛋白片段-人 CUZD1 (Pro218~Arg479)。该片段 位于胞外区，具有较强的抗原性，较易在原核中形成可溶表达。依据 uniport 中 Q86UP6 所对 应的蛋白及核酸序列设计引物如下，引物分别含有一个 EcoRI 的酶切位点和一个 XhoI 的酶切 位点，用于后期重组载体的构建：
[ PRIMER INFORMATION ]
Upstream Primer: CGgaattcCCCTCCACCAACTCTGGC
Downstream Primer: CCGctcgagCTATCTCCCATAGTGTCCAAATAAGG
在基因克隆过程中采用高保真酶进行扩增，获得一个片段大小约为 800bp 的 cDNA 片段。测序正确后，采用传统的双酶切法与大肠杆菌表达载体 pCC-GST 连接，并用于 后期的蛋白表达，测序结果如图 1 所示。
图 1 pCC-GST-rh CUZD1 T7 terminator primer 反向测序结果
pCC-GST 是由我公司自主构造的原核重组表达载体，具有两个 融合蛋白表达标签，his 标签和 GST 标签，该重组载体生产的蛋白不 但可用多种方法纯化检测，同时还可以提高蛋白的可溶性以及免疫原 性。在表达标签和多克隆位点间具有一个蛋白酶酶切位点，可用于重 组标签的去除。
经过 IPTG 诱导大肠杆菌进行外源重组蛋白表达后，获得一个大 小约为 59KDa 的重组蛋白（货号 RPQ635Hu01），如图 2 所示。
预测其蛋白序列为图 3 所示序列。
所获得的序列经过 ncbi 序列比对后发现，与人 CUZD1 的相似性为 100%，证明我们获得 了正确的重组蛋白片段，如下图 4 所示：
Sequence Alignment Results (NCBI reported):
采用镍柱纯化的方法获得纯化后的重组蛋白 CUZD1 后，制备出小鼠抗人 CUZD1 的单克 隆抗体，并采用亲和层析的方法获得高特异性的纯化抗体（货号 MAQ635Hu21），同时免疫兔子 获得兔抗人 CUZD1 的多克隆抗体（货号 PAQ635Hu01）。
对相应抗体的质量进行了一系列检测，包括 Western blot，IHC 等多种检测，检测结果如 下图（图 5、6）所示。我们检测了人胰腺癌细胞株 BXPC-3,如图中显示。我们在未怀孕大鼠 的子宫样本检测中未获得信号，进一步验证了 CUZD1 表达的特异性。
IHC 检测过程中我们使用了人胰腺癌细胞的石蜡组织切片，检测结果表现出很强的阳性 信号，主要表达在细胞膜上。以上实验证明我们获得了高质量的人 CUZD1 抗体。
Cloud-Clone Corp.利用已获得的蛋白及抗体研发出对应的 ELISA 检测试剂盒（ELISA Kit for CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，SEQ635Hu）。该试剂盒采用双抗 夹心原理，捕获抗体采用抗人 CUZD1 单抗，检测抗体采用 CUZD1 多抗。标准品使用高纯度 原核表达的重组蛋白（去除蛋白标签）。该试剂盒灵敏度及特异性高，适用于人源样本中 CUZD1 含量的检测。
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