氨基端前脑钠素(NT-proBNP)-心力衰竭的生物学标记物
氨基端前脑钠素（N-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide，简称 NT-proBNP）， 心肌细胞合成的脑钠肽原分泌到血液中后，会在内切酶的作用下分解产生 BNP （BNP 的具体介绍，请关注专题脑钠肽 BNP-心力衰竭的重要标记物）和 NT-BNP， 见图1。由于 NT-BNP 不具备生物活性，在体内半衰期长，易于长时间跟踪，所以 可作为临床对心血管类疾病监测的标志物，国内外心血管研究人员对其颇感兴趣。 2004年和2008年国际专家系统阐述了 BNP 和 NT-proBNP 的生物学和临床应用特 点。近年来，NT-BNP 的检测也逐渐被我国各级医院和医师广泛用于临床，作为心 力衰竭诊断和评估的生物学标记物，我国在2007年《慢性心力衰歇诊断治疗指南》 和2010年《急性心力衰竭诊断和治疗指南》也推荐将 NT-proBNP 用于心衰的诊断 和愈后判断。
基于 NT-BNP 在心力衰竭监控中的重要作用，Cloud-Clone Corp.公司一直对其 非常关注，关于 NT-proBNP 的系列产品也应运而生，具体产品研制介绍如下。
首先，Cloud. Clone Corp. 利用高通量的表达系统表达重组 NT-proBNP。 对应 NCBI 中 NM_002521 的 CDS（编码脑钠肽原的核酸序列）确定编码 NT-proBNP 的 mRNA 序列， 并于 C 端引入终止子密码子（TAA），以此作为模板来设计引物。
[PRIMER INFORMATION]
Upstream Primer: CGGAATTCCACCCGCTGGGCAGCC
Downsream Primer: CCGCTCGAGTTATCGTGGTGCCCGCAGG
完成引物设计后，利用 PCR 技术获得片段为 231bp 的 DNA 片段。测序正确后， 采用传统的双酶切与 Cloud-Clone Corp.自主构建的大肠杆菌表达载体 pUSCNK-2 进行连接，并用于后期的蛋白表达，测序结果如图 2 所示。
1 CACCCGCTGGGCAGCCCCGGTTCAGCCTCGGACTTGGAAACGTCCGGGTTACAGGAGCAG
61 CGCAACCATTTGCAGGGCAAACTGTCGGAGCTGCAGGTGGAGCAGACATCCCTGGAGCCC
121 CTCCAGGAGAGCCCCCGTCCCACAGGTGTCTGGAAGTCCCGGGAGGTAGCCACCGAGGGC
181 ATCCGTGGGCACCGCAAAATGG TCCTCTACACCCTGCGGGCACCACGATAA
图 2 pUSCNK-2 人 NT-proBNP 测序结果
体外 IPTG 诱导表达，获得一个大小约 12.3KD 的重组蛋白（融合 his-tag 和 T7-tag），采用镍柱纯化，获得纯化后的重组蛋白 NT-proBNP（货号 RPA485Hu01）， 蛋白序列信息如图 3 所示。
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSEF-HPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVWKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA PR 图 3 人 NT-proBNP 重组蛋白序列信息
通过 SDS-PAGE 验证纯化得到的重组蛋白，纯度大于95%，SDS-PAGE 结果 如图4。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，并通过单克隆抗体制备方法获得抗人 NT-proBNP 的单克隆抗体，然后采用亲和层析法获得高特异性的纯化抗体。同时 该蛋白免疫家兔后，经过纯化制备了兔抗人 NT-proBNP 的多克隆抗体（货号 PAA485Hu01）。
对于纯化的抗体，用 Western Blot 对其纯度和特异性进行了检验，结果如图5 所示。
将获得的高纯度的蛋白以及高特异性的抗体作为原料，Cloud-Clone Corp.自主 研制出相应的人氨基端前脑钠素 ELISA 定量检测试剂盒（货号 SEA485Hu）及 CLIA 定量检测试剂盒（货号 SCA485Hu）。方便广大科研工作者准确定量生物样本中的 NT-proBNP 含量，提供研究依据。产品详细信息如图 6，科研工作者们可以根据需 要，对产品进行选购。
更多相关产品，请查询 www.cloud-clone.us。