RNAi技术——了解生命的新视角

20049月,《自然》首次刊登了美国科学家Andrew Z. FireCraig C. Mello等人撰写的关于RNA干扰的成果文章,揭示了小RNA在生物生命活动中重要的调控作用开始,现在几乎每天都会有文章对各种小RNA与机体发育等生命活动之间关系的进展进行报道。而精明的生物技术公司也正在以惊人的速度积极地将RNAi技术运用于药物筛选研究。云克隆现已针对慢病毒与腺病毒表达系统展开了一系列服务项目,其中就有RNAi这一项。

RNAi (RNA interference) RNA干扰,是由双链RNAdsRNA介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi 广泛存在于生物的各种生命活动中。

RNA干扰的实验流程图如下:

                                      

以人CDHE基因为例,我们通过工具网站及查阅文献选取出三个RNAi的靶位点,将三个靶位点的shRNA骨架插入pLKO.1载体,得到重组质粒:pLKO.1-shCDHE-1, pLKO.1-shCDHE-2, pLKO.1-shCDHE-3,测序验证是否正确,得到验证结果后,选择正确的重组质粒进行瞬时转染。

那么通过哪些方面可以检测RNA的干扰效率呢?

mRNA水平我们RT-PCRReal-time PCR)进行检测,检测结果如图1所示

   

RT-PCT结果可见,在两种细胞中sh-CDHE-2都能下调CDHE mRNA的水平,RNAi有效果。

蛋白质水平我们可以用Western-blotELISA免疫组化的方法进行检测,检测结果如图2所示:

                                        

WB结果可见,在293T细胞中sh-CDHE-12均有一定效果,能下调相关蛋白的表达,与RT-PCT结果一致。

由于使用RNAi技术可以特异性干涉特定基因的表达(长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性),所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

云克隆正在进一步挖掘RNAi技术潜在的强大功能。目前除基因沉默外,云克隆还开展了基因过表达及基因敲除项目,三个项目齐头并进,均取得了显著的成效。

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