双抗夹心ELISA实验操作流程
1. 酶标板包被抗体流程：
1.1按说明书推荐的比例稀释包被抗体，或者设计预实验用倍比稀释的方式稀释包被抗体，酶标孔中加100ul包被抗体包被。酶标板加上覆膜，4oC温育过夜或37oC温育2小时。
1.2弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟。在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。此过程也可采用喷射瓶，多道移液器 或自动洗板机来完成。
1.3每孔加入200ul封闭液封闭，37oC温育1.5小时。
1.4 弃去孔内液体，甩干，洗板1次，方法同步骤1.2。酶标板包被抗体完成。
2. 实验流程
2.1按说明书推荐的方法稀释成不同浓度的标准品工作液，或设计预实验设定倍比稀释的多个标准品工作液。酶标板中依次加入100μL不同浓度的标准品，空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。
2.2 弃去孔内液体，甩干，洗板1次，方法同步骤1.2。
2.3 按说明书推荐的稀释倍数或使用多个不同稀释倍数稀释检测抗体（生物素标记的单/多克隆抗体），酶标板中每孔加入100μL稀释后的检测抗体，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。
2.4 弃去孔内液体，甩干，洗板3次，方法同步骤1.2。
2.5 每孔加酶标亲和素工作液（临用前配制）100μL，酶标板覆膜，37oC温育30分钟。
2.6 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤1.2。
2.7 每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37oC避光显色（反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
2.8 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
2.9 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长或450/630nm双波长测量各孔的光密度值（O.D.值）。