蛋白活性实验-细胞增殖/抑制实验方案
细胞增殖/抑制实验方案
一、实验目的：
通过检测待测蛋白对某种细胞的有促进增殖或抑制增殖的作用来评价该蛋白的生物活性。
二、实验仪器：
倒置显微镜 酶标仪 超净工作台 CO2培养箱
三、相关试剂、耗材：
96孔细胞培养板 胎牛血清 DMEM/1640培养基 CCK8试剂盒
四、实验步骤：
1 .将待测细胞消化后，用10% DMEM/1640培养基重悬稀释，按2000-5000 cells/孔接种到96孔板中，每孔100μl。可根据细胞自身生长状态适当调整接种浓度，抑制实验可多接种一些。当细胞贴壁后，换无血清的DMEM/1640饥饿过夜。
2. 将孔内无血清培养基吸出弃掉，加入用低浓度血清培养基（含1%-5%胎牛血清） 稀释的待测蛋白，每孔100μl。待测蛋白一般按照10倍梯度稀释，对照孔加入不含待测蛋白的培养基。
3. 将加入待测蛋白后的96孔培养板放入CO2培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞生长。
五、检测方法：
CCK8测定，使用酶标仪在450mM波长处测定OD值。
注意事项：
1. 细胞接种密度要适中，在4倍镜下观察大概占孔板面积30-40%，不能超过50%，否则细胞增殖过快不易观察结果。密度过低细胞增殖慢，用CCK8测定结果不明显。不同细胞增殖速度不同，要根据细胞生长特性适当调整细胞接种密度。
2. 为了降低血清对细胞增殖的影响，贴壁细胞用无血清饥饿过夜后，应该用低血清培养基培养，血清浓度不超过5%。
3. 对于悬浮细胞无法进行无血清饥饿，直接用低浓度血清稀释到合适的浓度接种到96孔板上。
4. 注意种属特异性，如有种属特异性，人源重组蛋白要在相应的人源细胞系上开展蛋白活性实验，鼠源重组蛋白需要在相应鼠源细胞系上进行试验。