实时荧光定量PCR实验操作流程
一、实验器材及试剂
1、 实验器材
多样品研磨珠均质仪
台式高速冷冻型微量离心机
荧光定量PCR仪
超净工作台
分光光度计
离心管
TIP头
2、 主要实验试剂及耗材
RNA提取液
三氯甲烷
异丙醇
无水乙醇
HyPure TMMolecular Biology Grade Water
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)
引物
75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制
离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃ 下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃ 放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃ 孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。
3、定量PCR
1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2× qPCR Mix12.5μl
7.5μM基因引物2.0μl
反转录产物2.5μl
ddH2O8.0μl
2）PCR扩增
预变性95℃，10min
循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s
熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃
4、结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2-K