蛋白质印迹（Western Blot）实验操作流程
1.制胶
1）试剂
浓缩胶缓冲液：1M Tris-HCl, pH 6.8, 0.4% SDS
分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl, pH 8.8, 0.4% SDS
丙烯酰胺储存液：29%丙烯酰胺+1.0%亚甲双丙烯酰胺
10%过硫酸铵
TEMED(N，N，N‘，N’-四亚甲基乙二胺)
电泳缓冲液：0.025M Tris Base, 0.192M Glycine, 0.1% SDS
考马斯亮蓝凝胶染色液：0.2%考马斯亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸
考马斯亮蓝凝胶脱色液：30%甲醇，10%乙酸
2）设备
微型凝胶装置：Bio-Rad Mini-Protean 3 Dodeca Cell
电源：Bio-Rad PowerPac HC
梯度凝胶仪：Bio-Rad Model 485 Gradient Former
3）实验操作
在烧杯中按如下成分配制凝胶液，灌注凝胶前应加入过硫酸铵和TEMED。
分离胶(10 ml) | 浓缩胶(2ml、6ml) | |||||
分离/浓缩胶浓度 | 8% | 10% | 12% | 15% | 5% | 5% |
分离胶缓冲液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | — | — |
浓缩胶缓冲液 | — | — | — | — | 0.25 | 0.75 |
丙烯酰胺储存液 | 2.6 | 3.3 | 4 | 5 | 0.33 | 1 |
ddH2O | 4.8 | 4.1 | 3.4 | 2.4 | 1.4 | 4.2 |
10% 过硫酸铵 | 0.1 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.02 | 0.06 |
TEMED | 0.06 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.002 | 0.006 |
2. 灌注分离胶
加入过硫酸铵和TEMED后，立即轻轻混合，将溶液小心倒入胶槽。当分离胶溶液高度达到约150px时停止灌注，在分离胶溶液上倒入约0.5ml异丙醇，以保持凝胶表面平整，静止放置10-30min使凝胶凝固。
3. 灌注浓缩胶
当分离胶凝固后，分离胶和异丙醇之间会出现一个分离界面。去除异丙醇，用蒸馏水冲洗表面。加入过硫酸铵和TEMED后，立即轻轻混合浓缩胶，将溶液倒入胶槽，直到溶液到达前板顶部。小心地将梳子插入凝胶中，直到梳子的底部到达前板的顶端，静止放置10-30min使凝胶凝固。
4. 加样
浓缩凝胶凝固后，拆卸梳子，将凝胶放入电泳室，在内外储层加电泳缓冲液。将样本和适量蛋白质标记装入孔中（每个样本20-25ug总蛋白）
5. 凝胶电泳
盖上盖子，并将电极插头连接到合适的电极上。打开电源调整电压至80V，电泳约30分钟。当样品形成单条窄线并进入分离胶时，将电压转换为150V，当移至凝胶底部时，停止电泳。大约需要40-60min。
6. 凝胶转移
1）试剂
10X转膜液：0.25M Tris, 1.92M甘氨酸，稀释至1X缓冲液后加入甲醇使其浓度为10%，需现配现用。
封闭液：1 X PBS, pH=7.4加入5.0%脱脂奶粉
PVDF膜
2）设备
转膜仪：Bio-Rad Trans-Blot Cell
电源：Bio-Rad PowerPac H
7. 电转
依次将PVDF膜置于100%甲醇中30秒，转膜液中至少1min。按照说明书装好电转仪，在电转仪上一次铺好海绵、滤纸、膜、胶、滤纸、海绵，填充预冷转膜缓冲液，并将电极连接起来。将电流设置为50 mA，转膜过夜。
8. 封闭
将PVDF膜转移至封闭液中。在摇床上室温摇动1小时，或4℃过夜。
蛋白质印迹
1）试剂
20×TBS (pH7.4)：0.1M Tris, 1M NaCl。
TBST溶液：1×TBS, 0.05% Tween-20。
抗体稀释液：将5%脱脂奶粉加入到TBST溶液中，现配现用。
显影液/定影液
洗膜缓冲液: TBST
一抗
二抗：如山羊抗兔IgG（SAA544Rb19）
辣根过氧化物酶底物
X线
2）设备
摇床
9. 孵育一抗
1) 用抗体稀释液稀释一抗至合适的浓度，在室温下用振动孵育1小时或4℃振动孵育过夜。
2) 洗膜：倒出一抗溶液，用洗膜缓冲液洗膜3次，每次5min。
10. 孵育二抗
1) 用抗体稀释液稀释二抗（1:5000，山羊抗兔IgG），室温下用振动孵育1小时。
2) 洗膜：倒出二抗溶液，用洗膜缓冲液洗膜3次，每次5min。
11. 暗室曝光
在暗室里，将PVDF膜浸润在ECL底物溶液1min左右，然后用保鲜膜将PVDF膜包好，放入暗盒，进行显影曝光。