蛋白活性实验-细胞迁移侵袭实验
细胞transwell 迁移侵袭实验方案
一、实验目的：
主要用于趋化因子家族或者某些补体以及某些具有趋化活性的蛋白活性检测。
二、实验仪器：
倒置显微镜 酶标仪 超净工作台 CO2培养箱
三、相关试剂、耗材：
24孔transwell小室 胎牛血清 DMEM/1640培养基 结晶紫 基质胶
四、实验步骤：
A. 细胞迁移
1 . 将细胞消化，终止后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1-2 遍，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1~5×105左右，每孔100-200μl加入小室上室中。
2. 下室加入用无血清培养基按5-10倍梯度稀释的待检测蛋白，每孔500μl。对于贴壁细胞，下室可加入含1-2% FBS低血清培养基。
3. 阳性对照孔的设置，下室加入10% FBS的培养基；阴性对照孔设置为下室加入不含待测蛋白不含血清的细胞培养基。
4.将transwell板放入5% CO2 ，37℃培养箱中，60-90min后观察结果。
B. 细胞侵袭
1. 包被基质胶，根据说明书上推荐的浓度进行稀释包被transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
2. 其它步骤同细胞迁移一样，观察实验结果前需用棉签擦掉transwell小室上的基质胶
检测方法：
1. 悬浮细胞穿过膜后会直接掉入下室，移除上室，用倒置显微镜观察可直接计数，在高倍镜下随机选取5个视野进行计数，最后计算平均值。或者收集下室培养液，用流式细胞仪计数。
2. 贴壁细胞的计数：将上室培养液吸出，弃掉，等膜风干后用0.1%结晶紫染色，把Transwell小室反过来底朝上用正置显微镜观察在高倍镜下随机选取5个视野进行计数或者用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570 nm 测其OD值，间接反映细胞数。
注意事项：
1. 根据趋化实验的靶细胞选择合适的趋化滤膜的孔径，中性粒细胞用3μm孔径的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes），单核细胞用8μm孔径的PVPF聚碳酸膜，淋巴细胞则用5-8μm孔径的PVPF。
2. 趋化时间，通常中性粒细胞趋化时间为30分钟，单核细胞趋化时间为90分钟，淋巴细胞趋化时间为180分钟。具体趋化时间需要参考文献或者根据实际实验情况而定，贴壁细胞通常要24小时以上。
3. 趋化因子浓度的确定： 由于趋化因子的特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续稀释（5倍或10倍系列稀释）以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照，因为不同来源或不同活力靶细胞的趋化能力差异很大。趋化因子活性的表达方式有三种，其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数（chemotactic index,CI）是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值。
4. 细胞侵袭常用8.0、12.0μm膜，有侵袭能力的细胞才可用于 Transwell 侵袭实验，侵袭实验前最好先检测细胞基质金属蛋白酶（MMPs）的表达情况。