免疫荧光实验操作流程
1. 烘片:60℃烘片0.5-2小时。
2. 脱蜡水化:烘片结束后,石蜡切片依次置于以下试剂中:
1)二甲苯I:30 min
2)二甲苯II:30 min
3)100%乙醇:10 min
4)95%乙醇:10 min
5)80%乙醇:10 min
6)70%乙醇:10 min
7)自来水冲洗10 min
3. 抗原修复-微波炉抗原热修复法(可选):将组织切片转移到沸腾的EDTA-Tris 溶液中使其完全浸透。低火加热1min,停止加热并静置于微波炉中10min。然后再低火加热3-4min,停止加热,使EDTA-Tris 溶液在室温自然冷却。
4. PBST漂洗3次:去除残留并浸泡在PBST中,在摇床中以40 RPM漂洗5 min,重复3次。
5. 阻断内源过氧化物酶:用3%-5% H2O2室温孵育10min。
6. PBST漂洗3次:去除残留并浸泡在PBST中,在摇床中以40 RPM漂洗5 min,重复3次。
7. 封闭:去除残留,用5%BSA室温孵育20 min。
8. 孵育FITC偶联的抗体:去除残留,选择适当的稀释比例稀释FITC偶联的抗体,每张片子100-200ul抗体覆盖组织,4℃避光孵育过夜。
9. PBST漂洗3次:去除残留并浸泡在PBST中,在摇床中以40 RPM漂洗5 min,重复3次。
10. 染核,用DAPI染核,每张片子100-200ul抗体覆盖组织,闭光孵育15min。
11. 滴加50%PBS+50%的甘油后,立即在荧光显微镜下观察。