蛋白活性实验-CD14活性蛋白
蛋白活性实验-CD14活性蛋白
CD14作为一种共受体(连同toll样受体TLR 4和MD-2)用于检测细菌脂多糖(LPS)。CD14只能在脂多糖结合蛋白(LBP)存在的情况下结合LPS。虽然LPS被认为是其主要的配体,但CD14也能识别其他的与病原体相关的分子模式,如lipoteichoic acid。此外,脂多糖结合蛋白(LBP)已被鉴定为CD14的中间体,因此进行了ELISA结合检测,以检测重组人CD14和重组人LBP的相互作用。
活性实验:用含0.01%的BSA 的PBS (PH7.4)稀释CD14。将100μl样本转移到LBP预包被板中37℃孵育2 h。用抗CD14多抗孵育1小时后用PBST冲洗,,然后吹吸,冲洗3次。经HRP标记的二次抗体孵育后,吹吸洗涤3次。加入底物溶液,在37℃孵育15 - 25分钟。最后,在孔中加入50ul终止液,并立即在450nm处读取。
CD14还可以通过THP-1人急性单核细胞白血病细胞增强LPS刺激的IL-8分泌。因此,THP1细胞培养在24孔板106细胞/毫升的浓度和刺激(1μg /毫升),然后添加不同浓度的重组体人CD14(1μg /毫升,5μg /毫升)。24h后,通过细胞因子特异性ELISA测定了在上清液中IL8的含量。
实验结果:CD14和LBP的结合活性如图1所示,其作用是剂量依赖性的。CD14的浓度5μg /毫升时,分泌LPS-stimulated引发可以显著增加。结果如表1和图2所示。
Figure 1. The binding activity of CD14 with LBP
O.D. value | Corrected | Concentration of IL8(ng/mL) | |
stimulated with LPS (1μg/ml) and rh CD14(5μg/ml) | 1.227 | 1.198 | 0.805 |
stimulatedwith LPS (1μg/ml) and rh CD14(1μg/ml) | 0.915 | 0.886 | 0.594 |
stimulatedwith LPS (1μg/ml) | 0.89 | 0.861 | 0.578 |
Table 1. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells
The standard curve was demonstrated as follows:
STD (ng/mL) | O.D. value | Corrected |
2.5 | 3.556 | 3.526 |
1.25 | 2.245 | 2.215 |
0.625 | 1.097 | 1.067 |
0.3125 | 0.329 | 0.299 |
0.15625 | 0.188 | 0.158 |
0.078125 | 0.117 | 0.087 |
0.0390625 | 0.065 | 0.035 |
Figure 2. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells