蛋白活性实验-CD14活性蛋白

蛋白活性实验-CD14活性蛋白

CD14作为一种共受体(连同toll样受体TLR 4MD-2)用于检测细菌脂多糖(LPS)CD14只能在脂多糖结合蛋白(LBP)存在的情况下结合LPS。虽然LPS被认为是其主要的配体,但CD14也能识别其他的与病原体相关的分子模式,如lipoteichoic acid。此外,脂多糖结合蛋白(LBP)已被鉴定为CD14的中间体,因此进行了ELISA结合检测,以检测重组人CD14和重组人LBP的相互作用。

 

活性实验:用含0.01%的BSA 的PBS (PH7.4)稀释CD14。将100μl样本转移到LBP预包被板中37℃孵育2 h。用抗CD14多抗孵育1小时后用PBST冲洗,,然后吹吸,冲洗3次。经HRP标记的二次抗体孵育后,吹吸洗涤3次。加入底物溶液,在37℃孵育15 - 25分钟。最后,在孔中加入50ul终止液,并立即在450nm处读取。

 

CD14还可以通过THP-1人急性单核细胞白血病细胞增强LPS刺激的IL-8分泌。因此,THP1细胞培养在24孔板106细胞/毫升的浓度和刺激(1μg /毫升),然后添加不同浓度的重组体人CD14(1μg /毫升,5μg /毫升)。24h后,通过细胞因子特异性ELISA测定了在上清液中IL8的含量。

 

实验结果:CD14和LBP的结合活性如图1所示,其作用是剂量依赖性的CD14的浓度5μg /毫升时,分泌LPS-stimulated引发可以显著增加。结果如表1和图2所示。

 

 

Figure 1.  The binding activity of CD14 with LBP

 

 

Sample (cell supernatant of THP1 cells)

O.D. value

Corrected

Concentration of IL8(ng/mL)

stimulated with LPS (1μg/ml) and rh CD145μg/ml

1.227 

1.198

0.805

stimulatedwith LPS (1μg/ml) and rh CD141μg/ml

0.915

0.886

0.594

stimulatedwith LPS (1μg/ml)

0.89

0.861

0.578

 

Table 1. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells

The standard curve was demonstrated as follows

STD (ng/mL)

O.D. value

Corrected

2.5

3.556

3.526

1.25

2.245

2.215

0.625

1.097

1.067

0.3125

0.329

0.299

0.15625

0.188

0.158

0.078125

0.117

0.087

0.0390625

0.065

0.035

 

Figure 2. Effects of CD14 on IL8 production by THP1 cells