流式细胞术检测细胞分子实验步骤

一、流式细胞术检测细胞胞膜分子

1. 细胞重悬细胞处理计数后,用细胞洗液(含2% BSA的PBS)重悬细胞,使细胞浓度为1×107/mL;

2. 对照设置:空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞,使每管细胞数达到1×106/管;

3. 一抗孵育:空白对照管不加抗体,同型对照管和待测样本管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体(具体使用量参照说明书),充分混匀,至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管,使细胞和抗体充分反应;

4. 细胞清洗:加入适量细胞洗液,1000rpm离心5min,弃上清,反复洗涤2次;

5. 细胞重悬:使用100μL细胞洗液重悬细胞;

6. 二抗孵育:同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记的二抗,充分混匀,至4℃避光孵育30min或冬季可至于室温避光孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管;

7. 细胞清洗:加入适量细胞洗液,1000rpm离心5min,弃上清,反复洗涤2次;

8. 上机检测:使用100-200μL细胞洗液重悬细胞,先测空白管和同型对照管,再测待测管。

 

二、流式细胞术检测细胞胞浆分子

1. 准备细胞:细胞处理计数后,1000rpm离心5min,弃上清,用细胞洗液(含2% BSA的PBS)涤细胞一次;

2. 细胞固定:按照每2×106个细胞加入1mL 4%多聚甲醛的比例使用4%多聚甲醛固定细胞,室温固定10~15min;

3. 细胞清洗:加入细胞洗液,1000rpm离心5min,弃上清,重复清洗一次;

4. 细胞破膜:用破膜剂重悬细胞,加入至1.5mL EP管中,1*106/管,体积为100μL/管;

5. 对照设置:空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞,使每管细胞数达到1×106/管;

6. 一抗孵育:空白对照管不加抗体,同型对照和待测管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体(具体使用量参照说明书),充分混匀,至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管,使细胞和抗体充分反应;

7. 细胞清洗:加入适量的穿膜剂,1000rpm离心5min,弃上清,重复洗涤细胞2次;

8. 细胞重悬:用100uL穿膜剂重悬细胞;

9. 二抗孵育:同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记二抗,充分混匀,至4℃避光孵育30min或冬季可至于室温避光孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管;

10. 细胞清洗:加入适量的穿膜剂,1000rpm离心5min,弃上清,重复洗涤细胞2次;

11. 上机检测:用100-200uL穿膜剂重悬细胞,先测空白管和同型对照管,再测待测管。