抗CD45抗体用于吞噬作用研究——云克隆抗体又登Cell

文章主题:Size-Dependent Segregation Controls Macrophage Phagocytosis of Antibody-Opsonized Targets

简单来说:抗原的大小是巨噬细胞进行有效吞噬的决定性因素

信息及链接:Cell. 2018 Jun 28;174(1):131-142.e13. doi: 10.1016/j.cell.2018.05.059.

 

背景:巨噬细胞通过靶向抗体调理细胞进行吞噬作用来保护机体免受疾病损伤。尽管不同结构,形状和大小的抗原都能诱导产生抗体,但是为什么有些抗体在激发免疫应答等过程中比其他抗体更有效,这个机制还不清楚。在这篇文章中,研究者们就对其中的机制进行了研究。

 

亮点:

1. 抗体依赖的巨噬细胞吞噬作用依赖于抗原的大小;

2. 短抗原促进细胞之间的紧密接触以及CD45的分离;

3. CD45的分离不依赖于整合素,会引起ITAM的磷酸化;

4. 靶向短抗原的抗体促进有效的吞噬作用。

下面我们来看看研究者们是怎么通过精巧的实验设计,最终得到这些结论的:

 

首先,通过设计一组体外模型(包裹脂质双分子层(SLB)和抗体的玻璃微球)模拟被巨噬细胞吞噬的靶物质,然后将微球与RAW264.7巨噬细胞细胞共孵育,通过共聚焦显微技术观察体外模拟的巨噬细胞吞噬过程。

结果显示:吞噬作用随着抗体浓度的升高而增强,同时,还能通过与巨噬细胞共培养的抗CD16(FcϒRIII)和抗CD32(FcϒRIIIB)的抗体共孵育而被阻断,说明SLB包裹的微球内化是FcϒR特异性的。

此后,为了了解抗原大小对于吞噬作用的影响,研究者们先后设计了两组基于Fibcon和CEACAM的不同长度的抗原。观察吞噬过程发现:巨噬细胞对微球的吞噬作用随着微球上包裹抗原增长而显著降低。

由于吞噬作用和抗体浓度是相关的,所以为了证明抗原长度对吞噬作用的影响不仅仅发生在某个特定的抗体浓度,研究者又设计了不同抗体浓度下的实验。(逻辑是不是很缜密?)

结果显示:不同的抗体浓度下吞噬作用与抗原长度还是呈负相关的趋势,并且当抗原长度大于10nm时,会显著降低吞噬作用

 

接下来,为了研究吞噬依赖于抗原长度的原因是否在于ITAM信号变化,研究者们观察了吞噬过程中磷酸化酪氨酸在细胞中的分布,结果发现:短抗原内化过程中有丰富的ITAM酪氨酸磷酸化,但长抗原则没有。

而为了确定FcϒR ITAM磷酸化是否随着抗原长度改变而发生了变化,他们应用全内反射荧光显微镜(TIRF)对特定设计的ITAM磷酸化传感器(sensor)进行观察,了解ITAM磷酸化的动力学。

结果显示:随着抗原长度增加,sensor的富集程度显著降低,并且,这种依赖于抗原大小的FcϒR ITAM磷酸化还不仅仅出现在单个的抗原家族中,也就是说有一定的普遍性。

 

进一步来说,由于靶物质上抗体浓度可以调节吞噬作用,为了确定不同长度的抗原簇中FcϒR的有效浓度不同是不是导致吞噬作用与抗原长度相关性的主要原因,通过计量抗体-FcϒR复合物的浓度发现,长抗原对应的抗体浓度比短抗原只有轻微降低,而这个现象可以由二维空间内受体-配基的亲和力依赖于他们的大小尺寸得以解释。进而研究者们还通过构建大质膜泡,检测到抗原长度变化只会引起受体-配基亲和力的轻微降低,进而说明吞噬作用主要依赖于抗原大小的差异,而不是亲和力或者密度

 

FcϒR ITAM的磷酸化能够被受体酪氨酸磷酸酶CD45、CD148逆转,为了研究抑制磷酸酶在抗体FcϒR富集的膜上是怎样进行空间分布的,研究者们通过TIRF观察了CD45在巨噬细胞和SLB的接触面上的分布。

结果显示:短抗原参与的吞噬接触面上抗体与CD45之间有显著的分离,而长抗原则没有这种现象。同时,共定位分析及抗原、抗体及受体的计算分析显示:大约10nm的大小是一个阈值,当抗原长度小于这个阈值就会导致CD45被分离。

基于以上的结论,为了进一步求证CD45的分离对于FcϒR磷酸化和吞噬作用是否是必须的,研究者们使用CRISPR/Cas9截短了内源性的CD45胞外段进行实验,发现截短的CD45使短抗原介导的吞噬作用显著降低了。

综上,结论如下:抗原大小很大程度上决定了抗体依赖的吞噬作用是否成功,而这个吞噬作用又是通过大小依赖的CD45分离导致的FcϒR磷酸化来完成的。(做基础研究的文章,它的结论就是这么傲娇的拗口)

 

简单来说,是这样一个结论:

抗原大小越小会导致抗体结合的Fc受体与抑制性磷酸酶CD45分离,进而激发Fc受体磷酸化,并促进吞噬作用。由此作者为治疗性抗体提出一个建议:选取短抗原作为抗体的靶标。

本文中用于检测CRISPR/Cas9编辑的CD45分子的抗小鼠CD45抗体来自Cloud-Clone!!!