谷胱甘肽巯基转移酶(GSTp)活性检测

实验原理:

Glutathione S Transferase Pi (GSTp)谷胱甘肽巯基转移酶是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。它能催化机体内有害极性化合物与谷胱甘肽结合,防止DNA损害,还可以由非酶结合方式将体内各种潜在毒性化学药物从体内排出。GSTp能催化内源性谷胱甘肽与1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)结合形成2,4-二硝基苯-谷胱甘肽复合物,在340nm处有吸收峰。因此,测定产物生成量可反映GSTp的活性。


试剂:

100mM NaH2PO4 缓冲液,pH7.0

200mM L-谷胱甘肽(还原型)

100mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)


实验步骤:

1.取980μl 缓冲液(100mM NaH2PO4,pH7.0),分别加入10μl 配制好的L-谷胱甘肽(还原型)和10μl的CDNB,混匀后得到底物混合液。

2.取100μl底物混合液在微量比色皿中进行调零。

3.将50μl底物混合液与50μl用缓冲液稀释后的重组大鼠GSTp混匀。

4.在5min内测量OD340nm值。


结果计算:

GSTp的比酶活以1mg蛋白1min内产生1μmol复合物表示。

GSTp比酶活=

(εmM=9.6mmol/(L·cm),为CDNB与谷胱甘肽复合物在340nm下的摩尔吸光系数)


经检测,云克隆活性蛋白——大鼠重组GSTp(货号:APB090Ra01)的比酶活为4.025,即,1mg的APB090Ra01在1min内可生成4.025μmol复合物。