病毒的“拟”生长


“病毒”二字依据拆文解字意为引起疾病的毒素,与现代医学对其定义不谋而合。病毒是一类独特的传染因子,它能够利用宿主细胞的营养物质来自主地复制自身的DNA或RNA、蛋白质等生命组成物质的微小生命体。病毒的显著特点是结构简单,微小到甚至无法用普通显微镜观察,而且无法脱离活体进行独立的代谢活动和复制。

 

如此常见却又特别的病毒,要如何开展相应的科学研究呢?

 

从病毒特点中不难发现,它赖以生存的关键点就是活体细胞。随着对各类病毒的研究深入,迫切需要通过易感细胞建立体外感染模型。也就是本文题目中的提到的模拟病毒生存发展的“拟”生长。

 

  我们以引发全球性公共卫生问题的乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)作为研究对象进行体外感染的模拟实验的小科普。HBV是嗜肝病毒(如图1),肝脏是其主要的侵犯和复制场所,因此肝源细胞就成病毒DNA转染的首选靶细胞,研究者们选用的是经过转化后连续传代培养的分化的肝癌细胞,如HepG2细胞系[1]

图1 乙肝病毒为嗜肝病毒(图片来源于网络)

病毒体外感染形式分为两种:一种是用病毒直接感染细胞(如骨髓中的淋巴细胞、人胎盘滋养层细胞系Bewo细胞等[2],观察病毒的形态,确定细胞是否可被病毒体外感染以及研究病毒与细胞的相互作用为后续建立病毒检测、预防感染与治疗提供依据。

 

另外一种为了更深层次研究病毒基因组的功能,阐述乙肝病毒嵌入人类基因组的机制和病毒致癌的部分机制。通过构建乙肝病毒基因重组腺病毒载体,将携带HBV基因的重组腺病毒感染HEK293细胞进行包装、扩增、分离纯化,将扩增得到的HBV感染HepG2细胞[3]。鉴于病毒体外感染细胞模型的建立有助于对病毒颗粒形态、致病机理、复制与表达等基础性研究,而基础性研究的进展也促进体外细胞感染模型的建立[4-5]

 

在细胞模型已取得成功的基础上,更多的研究人员已将目光锁定在动物模型上。厦门大学夏宁邵教授团队和浙江大学附属第一医院李君教授团队历经5年的协同攻关,建立了国际上第一个高度模拟人类乙肝病毒(HBV)自然感染诱发的慢乙肝肝硬化小鼠模型。这是国内外首次利用单种的人BMSC移植实现了人同源肝细胞与多种免疫细胞在小鼠体内的双重嵌合,成功模拟了人类HBV自然感染和乙肝肝硬化发病过程,解决了HBV感染与发病机制研究和抗乙肝肝硬化新药研发缺少高质量动物模型的国际难题。

图2 人类乙肝病毒(HBV)自然感染诱发的慢乙肝肝硬化小鼠模型

 

云克隆一直致力于服务全球科研人员,提供优质的检测产品以及实验服务。我们深知细胞感染模型的重要性,我司目前可以提供成熟的腺病毒,慢病毒包装实验服务,也可制作千余种动物模型,涉及各种人类疾病动物模型、转基因动物模型和基因敲除动物模型。旨在为您的实验保驾护航。

 

[服务项目内容]

‍‍‍‍一、病毒包装实验服务

项目内容

实验流程周期

实验方案确定

‍‍1. 客户信息分析‍‍

‍‍2. 实验方案确定‍‍

‍1

目的基因获取

1. PCR获取目的基因片段‍‍

‍‍2. 基因化学合成‍‍

‍‍2-4

‍‍载体构建

1. 载体构建‍‍

‍‍2. 质粒提取和去内毒素处理‍‍

‍‍2-3

共转‍‍‍

‍‍1. 表达质粒和辅助质粒共同转染293(腺病毒)/293T细胞‍‍慢病毒

‍‍2. 细胞培养‍‍

‍‍1

重组病毒收集

‍‍1. 重组病毒收集、浓缩、分装和保存‍‍

‍‍2. 重组病毒滴度检测‍‍

‍‍1

二、肿瘤移植(TT)小鼠模型(示例)

目前在肝癌研究中多采用异体移植法将肿瘤细胞株注射到动物皮下形成局部瘤块来构建移植瘤模型,相比机体原发性肝癌的形成及病理生理学变化仍有一定不同。通过向裸鼠肝脏注射肝癌细胞建立肝脏原位肿瘤模型,观察其原位瘤成瘤的过程及状态,能较好的模拟人体肝癌生长过程,为进一步抗肝癌免疫研究提供实验动物模型。
1. 细胞株: 荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株HepG2-luc。
2. 裸鼠肝脏原位成瘤模型的建立:
2.1 将标准条件下培养的处于对数生长期的HepG2-luc 细胞消化、离心,将所得的约 5×10 6 个细胞溶于 0.1 mL DMEM 培养液待用。
2.2 使用3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,待麻醉生效后,开腹暴露肝脏,用1ml胰岛素注射针取准备好的细胞注射于裸鼠肝脏内,用5-0丝线缝合伤口,活力碘消毒伤口,将裸鼠放在加热垫上,待清醒后正常饮食饲养。
3. 荧光活体成像检测:在成瘤后对裸鼠进行生物发光活体成像检测,成像前使用3%戊巴比妥钠麻醉小鼠,再通过腹腔注射3mg底物 luciferin,底物注射后20~30分钟后进行生物发光活体成像检测。

图3 生物发光活体成像检测结果

 

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参考文献:

[1] Abraham T M , Lewellyn EB, Haines K M,et al.Characterization Of the contribution of spliced RNAs of hepatitis B virus to DNA synthesis intransfected cultures of Huh7 and HepG2 cells[J].Virology,2008,379:30-7.

[2] 刘明慧. 乙型肝炎病毒感染Bewo细胞模型的建立[J]. 中国妇幼保健, v.26(31):4901-4903.

[3] Benjamin Y. Winer et al, Analysis of host responses to hepatitis B and delta viral infections in a micro-scalable hepatic co-culture system, Hepatology (2019). DOI: 10.1002/hep.30815.

[4] 刁志宏,张明霞,朱幼芙,等.重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达[J].第四军医大学学报,2006,27(11):1008-10.

[5] 王安辉 徐德忠 门可 闫水平 张景霞 卢娟.乙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞的初步研究[J].世界感染杂志,2005,(06):536-536页.