如何让WB的结果更完美？
在Western Blot（WB）的实验过程中，总会遇到各种各样的问题：没有条带，杂带多，转膜不成功，曝光时间把握不好……不要着急，根据多年的WB经验，我们总结了以下WB实验过程中出现各种突发状况的分析和处理方法：
1. SDS-PAGE出现异常条带
1）微笑现象
处理方法：可能是由于凝胶的中间部分凝固不均导致，待其充分凝固后再做实验。
2）拖尾现象
处理方法：可能是由于样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起。建议：加样前离心；加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
3）条带粗
处理方法：可能是由于浓缩胶未浓缩好。建议：增加浓缩胶长度；保证浓缩胶的pH正确（6.7）；降低电压。
4）纹理现象
处理方法：可能是由于样本中不溶性颗粒引起的。建议：加样前离心；加适量样品促溶剂。
2. 转膜条件及膜的选择
下图为不同转膜方法的转膜效率：
可以观察到转膜效率：湿转过夜>湿转3小时>半干转1小时。
在转膜过程中，靶蛋白分子量小转印时间缩短，分子量大则适当延长转膜时间。并建议优先选择聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜，相对硝酸纤维素（NC）膜机械强度高，和蛋白结合牢。
3. 条带出现降解或断裂带
lane 13：心脏组织震动溶解2h；lane 14：心脏组织短时超声；lane 15：心脏组织超声10min
处理方法：样本制备过程中尽量保持低温，避免蛋白变性、降解、断裂，对于胃肠胰等蛋白酶含量高的样本建议添加蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂建议新鲜配制。
4. 曝光时间过长或过短出现非特异性带或条带消失
处理方法：建议选不同时间点多曝光几次。
5. 条带不整齐
处理方法：可能是由于胶凝固不均匀，建议待胶完全凝固后上样；可能是由于电泳的时候，有气泡在胶的下边缘，建议电泳前，检查并赶走胶底部的气泡；可能是由于上样buffer不是工作液浓度，建议重新配置上样buffer；可能是由于拔梳子导致样品孔不齐，建议水平缓慢的拔梳子。
6. 无条带
处理方法：可能是转膜失败，可以通过立春红染色检验；可能是一抗二抗用错或浓度不合适，可设置阳性对照或重新调整抗体浓度；ECL发光底物失效，可换用新的发光底物。
WB的实验流程相对较长，每个步骤都会对最后的实验结果造成影响。我们在实验过程中，应做好实验对照、实验记录，步步监测，方便查找原因。