PNGase F活性测定
实验原理
肽-N-糖苷酶F（PNGase F），可以在N-连接糖蛋白的高甘露糖、杂合和复合寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺和天冬酰胺残基之间进行切割。本试验以真核表达的重组Interferon Gamma（IFNg）蛋白为底物来测定重组肽-N-糖苷酶F的活性。
实验试剂及仪器
试剂：10×变性缓冲液：5% SDS，400mM DTT
反应缓冲液：50mmol/L Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40
仪器：SDS-PAGE电泳仪
实验步骤
将真核蛋白Interferon Gamma （IFNg）用1×变性缓冲液稀释成1μg/μL，在100℃煮沸10min使其变性。将重组蛋白PNGase F用反应缓冲液从1000ng/mL开始进行两倍稀释，每个浓度取10μL，再加入10μL变性IFNg蛋白在37℃下反应1h，最后在100℃煮沸5min终止反应，用SDS-PAGE检测结果。
结果及计算
酶活定义：
在10μL反应体系中，37℃条件下，1小时从10μg变性IFNg中去除超过95%的碳水化合物所需的酶量定义为一个单位。
Figure 1. The deglycosylation of IFNg detect by SDS-PAGE
结果显示，37℃条件下，1小时从10μg变性IFNg中去除超过95%的碳水化合物所需的PNGase F为2.5ng。
参考信息
云克隆货号：APX267Ge01