肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶活性实验
肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶（Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase, PAM）是多种多肽产生生物活性所必需的酶。它含有两个具有催化活性的酶活性域：肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶（PHM）和肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶（PAL）。这些催化结构域依次作用于将神经内分泌肽催化为活性的α-酰胺化产物。通常，将Dns-Tyr-Val-Gly底物水解为Dns-Tyr-Val-NH2作为PAM的典型活性测定法。
实验方法：
1. 在1mL含100mM MES / KOH（pH 6.0）、30mM KI，30mM KCl，1μmol/ L硫酸铜，100ug / mL过氧化氢酶，1％（v / v）乙醇，0.001％（v / v）Triton X-100、10mM抗坏血酸盐，0.35mM/L Dns-Tyr-Val-Gly（0.2mg / mL）的溶液中添加各种浓度的PAM（0.1ug / mL，1ug / mL，5ug /毫升）。
2. 在37℃温育30分钟。
3. 向反应体系中添加6％（v / v）TFA终止反应。
4. 通过RP-HPLC在280nm处进行UV检测，在25℃下使用Agilent ZORBAX Poroshell SB C18色谱柱（9.4×250mm，5μm）进行分析，流速为1ml / min。流动相由100 mM乙酸钠（pH 6.5）和35分钟的10-90％乙腈线性梯度组成。结果如图1所示。
实验结果：
图1.HPLC测定PAM的活性实验.
图2.反应产物与标准Dns-Tyr-Val-Gly 和Dns-Tyr-Val-NH2的比较.
图3.Dns-Tyr-Val-NH2的标准曲线.
Cloud-Clone提供的重组PAM（APC744Ra61）的活性为：2.4x106U（一个活力单位（U）定义为：37℃1分钟将1umol底物转化为酰胺产物）。