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2020年7月29日，来自中山大学中山眼科中心，国家重点实验室的Wei Chi教授在“The Ocular Surface”发表了题为“NLRP12- and NLRC4-mediated corneal epithelial pyroptosis is driven by GSDMD cleavage accompanied by IL-33 processing in dry eye”的文章。研究发现一种与NLRP12和NLRC4相关的炎症诱导、消皮素D依赖并伴有IL-33参与的焦亡机制。这种机制对受到环境影响产生的眼表上皮缺损负责。IL-33的处理以及之后扩大的炎症级联必须有消皮素D的参与。这预示着新的治疗靶点的出现。

                                                                                      产品：Gasdermin D蛋白(GSDMD)重组蛋白 

                                                                                      货号：RPE529Mu01                                    

                                                                                      来源：原核表达                                      

                                                                                      纯度：> 95%

研究简介：

干眼症是一种常见的多因素性自身免疫性眼表疾病。干燥（Desiccating stress, DS），高渗透压等环境因素会影响角膜上皮细胞，从而诱发眼表炎症。炎性小体引起的细胞焦亡是程序性细胞死亡的一种促炎形式。其以caspase-1/11 (CASP1/11)诱导消皮素D (GSDMD)促进细胞裂解为特征。而GSDMD是膜孔形成、细胞破裂和促炎细胞因子释放所必需的。

为了深入探究干眼引发的病理分子改变，作者对DS处理的小鼠角膜上皮细胞和对照组进行了RNA-Seq。分析结果表明，DS损伤涉及多个与炎症和免疫有关的通路。因为干眼症是自身免疫性疾病，因此作者通过研究免疫系统过程途径，发现焦亡关键底物GSDMD的表达在该途径上调。并且，与对照组相比，DS处理的小鼠角膜上皮中的GSDMD水平升高。为探究GSDMD在干眼症中的作用，作者敲除小鼠的GSDMD基因，发现在DS处理下，相较于正常小鼠，基因敲除小鼠泪水流失更少。此外，GSDMD基因的缺失减弱了眼表疾病，并导致角膜上皮缺损数量的减少。作者同样通过RNA-Seq筛选到TLR4，并进一步探究TLR4和GSDMD之间的调控机制。通过免疫荧光染色分析发现TLR4基因敲除小鼠中的GSDMD的表达显著降低。这些发现都证明TLR4在GSDMD上游起作用并且与焦亡有关。

作者在DS处理的小鼠角膜上皮细胞中检测到NLRP12和NLRC4水平的上升。在NLRP12和NLRC4基因敲除小鼠模型中，DS处理的第一天，泪液体积就迅速减少，NLRP12的缺失不仅显著降低了泪液减少的程度，而且显著改善了角膜缺损的愈合。这些发现表明，NLRP12和NLRC4作为促炎触发器，在干眼症发展过程中调节眼表疾病。通过qRT-PCR和免疫印迹实验，作者发现敲除NLRP12后NLRC4蛋白和mRNA水平显著降低，敲除NLRC4后NLRP12蛋白和mRNA水平显著降低。并且，NLRP12或NLRC4的敲除可显著阻断CASP1、IL-1和GSDMD的裂解，角膜上皮中的GSDMD显著降低，证实NLRP12和NLRC4诱发了干眼症中GSDMD依赖的焦亡。之后，作者使用YVAD抑制CASP1活性，抑制了IL-1β的生物活性以及N端的GSDMD生成，而重组CASP1蛋白的加入则相反地促进了IL-1蛋白和GSDMD的裂解。这些结果证实了NLRP12和NLRC4炎性小体在干眼症中相互调节并依赖CASP1诱导的GSDMD裂解促进焦亡作用。

作者假设NLRP12和NLRC4炎性体的激活可能参与了TLR4介导的焦亡。实验发现，在体内和体外，消除TLR4显著降低了NLRP12和NLRC4在蛋白和mRNA水平的表达。同时，免疫荧光染色检测到TLR4敲除小鼠角膜上皮中NLRP12或NLRC4的表达显著降低，并且NLRP12/NLRC4炎性体相关蛋白水平以及下游CASP1蛋白水解作用显著降低。因为CASP8是细胞凋亡的启动子，作者发现体内TLR4的异位缺失或体外敲低TLR4可明显抑制CASP8的激活。在CASP8敲除的小鼠中，眼表损伤减少，泪液明显增多，并且抑制了NLRP12和 NLRC4炎性小体体内体外活性。这都表明CASP8对DS引起的眼表疾病的恶化负一定的责任。

之后，作者为了探究IL-33在焦亡时的功能和机制，将重组IL-33蛋白和抗体分别应用于角膜，结果发现与DS组相比，重组IL-33蛋白组泪液生成明显减少，角膜缺损增加。并且，作者发现在GSDMD敲除小鼠中IL-33对角膜上皮的处理显著减少。在恢复GSDMD敲除小鼠的GSDMD的水平后，IL-33d的水平也明显上升。并且，NLRP12或NLRC4敲除和药剂阻碍CASP1小鼠的IL-33生物活性水平均下降。这都说明GSDMD引起的焦亡能刺激IL-33的合成。

自身免疫（autoimmunity）是在正常情况下，动物的免疫系统只对自身以外的异物抗原发生反应，但由于某些原因对自身构成成分引起免疫反应时，则称为自身免疫。自身免疫在哺乳动物中广泛存在，在正常条件下被视为机体正常防御的一部分，但是一旦自身免疫出现紊乱，便可以致病，出现自身免疫性疾病，比如：系统性红斑性狼疮、慢性淋巴细胞性甲状腺炎以及自身免疫性溶血等。现在一般认为自身免疫疾病的发病是个极其复杂的过程，涉及面较广，与遗传、病毒感染、免疫功能状况等密切相关，而抑制性T细胞功能降低及有免疫原性的自身抗原形成是其发病的中心环节。

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