LDHB调控猪瘟病毒 （CSFV）感染的新机制
2020年 9月 28日，来自华南农业大学的 Jinding Chen教授在 Autophagy上在线发表了题为“LDHB inhibition induces mitophagy and facilitates the progression of CSFV infection”的文章。该论文发现了 LDHB调控CSFV感染的新机制。
在 这 篇 文 章 中，云 克 隆 多 克 隆 抗 体（乳 酸 脱 氢 酶 B（Lactate Dehydrogenase B, LDHB）Polyclonal Antibody，PAB698Hu01）再次受到科研工作者的认可，荣登优秀国际期刊。
研究介绍
猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）是猪瘟的病原，它会引起仔猪出血综合征、高热以及器官损伤。CSFV是很小的折叠的单链正义 RNA病毒，它可以感染多种类型的细胞。人乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）作为糖酵解过程中的关键酶，具有两种分型：LDHA和 LDHB。许多研究表明，LDHB不仅在肿瘤细胞的代谢中起到了重要作用，同时被视为癌症标志物。并且，有证据表明 LDHB定位在线粒体中，参与多种关键细胞过程，包括 ATP的产生、凋亡、钙稳态、细胞增殖以及核苷酸和脂质合成。
多种内在和外在刺激引起线粒体的分裂与融合，并诱导线粒体自噬。在之前的研究中发现，CSFV诱导线粒体自噬作为一种抑制细胞凋亡的手段，有效促进病毒持续感染。此外，有报道称糖酵解是肿瘤、肝脏疾病和糖尿病等疾病模型中线粒体代谢的主要能量来源。同时，乳酸参与培养的 CHO细胞和 LDHB定位于线粒体的线粒体。基于这些结果，作者推测 LDHB可能对线粒体自噬产生影响。
为了探究感染 CSFV对乳酸和丙酮酸代谢的影响，作者用 CSFV侵染巴纳猪后观察-2、0、2、4、6、8天的乳酸和丙酮酸水平。结果表明，乳酸含量上升的同时丙酮酸含量下降。在体外多重感染 PG-15细胞也得到相同的结果。作者为进一步探究 LDHB是否参与此过程，在 CSFV感染前 24h转染 PK-15细胞的 LDHB RNAi，发现感染后 48h丙酮酸浓度上升，乳酸浓度没有变化。这一结果表明 CSFV感染通过 LDHB影响 PG-15细胞的乳酸和丙酮酸的代谢。
在之前的研究中，作者发现 LDHB是 CSFV N53蛋白的结合元件之一，在 CSFV复制中起到关键作用。作者分别转染了缺少 LDHB不同结构域的质粒和 HA-NS3质粒，发现 LDHB抑制 NS3的表达，同时 NS3也同样抑制 CSFV感染的PK-15和 3D4/2细胞中的 LDHB表达。
因为 LDHB定位在线粒体膜上，而线粒体自噬在 CSFV感染中起到关键作用，因此作者猜测 LDHB通过线粒体来影响 CSFV。于是，作者沉默了 LDHB，然后通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体形态和长度的变化。透射电镜图像显示，与对照组相比，沉默 LDHB的细胞的线粒体嵴明显减少。定量分析显示沉默 LDHB的细胞中自噬体样结构数量显著增加。激光共聚焦显微镜观察到先例体变短并且分裂增加。线粒体自噬往往会引起线粒体质量的减少。作者使用 3-MA处理 PK-15细胞，发现 3-MA逆转了沉默 LDHB的线粒体蛋白降解。并且，作者发现沉默 LDHB会提高MFN2泛素化。作者进一步使用串联质谱标签 mRFP-EGFP转染 PK-15和 3D4/2细胞，发现与转染 siNC的细胞呈现黄色荧光相比，转染了 siLDHB的 PK-15和 3D4/2细胞呈现更多的红色荧光，表明线粒体被溶酶体降解。这些结果表明，抑制 LDHB可诱导线粒体分裂和线粒体自噬。
作者使用 NFKB，IRF3和 IFNB双荧光报告基因，发现抑制 LDHB提高了 NFKB的转录活性，而超量表达 LDHB则减少了 NFKB的相对荧光。这些结果表明抑制 LDHB对 NFKB信号通路有正面影响。当作者感染 CSFV细胞时，siLDHB对NFKB信号的激活消失，细胞因子表达下降。这说明 siLDHB促进了 NFKB信号通路的激活，而 CSFV感染抑制了 NFKB信号通路的激活。
之后，作者开始验证 LDHB对 NFKB信号的抑制作用是否通过线粒体自噬调节。对细胞进行 shPRKN，shRNA空载，siLDHB的转染。结果显示 shPARK2可以抑制线粒体自噬，减少 NFKB信号通路上的蛋白表达量。这意味着 LDHB通过线粒体自噬途径调控 NFKB信号通路。同时，作者通过敲除 LDHB蛋白和超量表达 LDHB，发现抑制 LDHB可以促进CSFV的复制，而过表达 LDHB则会降低 CSFV的复制。检测 CSFV感染 24h后细胞上清中的 CSFV mRNA和病毒滴度后发现，它们在敲除 LDHB的细胞中含量上升，而在超量表达 LDHB的细胞中含量下降。这些结果表明 LDHB对 CSFV复制有着负面的影响。作者使用线粒体自噬的拮抗剂 CCCP、干扰质粒 shPRKN和 NFKB信号通路抑制剂 BAY处理 PK-15和3D4/2细胞，在感染 CSFV24h后病毒基因复制和 Npro蛋白表达缺失。这说明 LDHB通过细胞自噬通路和 NFKB信号通路来抑制 CSFV的复制。细胞的存活率并不受 RNAi影响。
细胞自噬
细胞自噬（autophagy）是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明，例如：细胞在饥饿过程中会启动自噬，但是也与许多病理过程相关比，如发育、分化、神经退行性疾病、应激、感染以及癌症。mTOR激酶是诱导自噬的重要调节分子，通过 mTOR激活 Akt和 MAPK信号转导可以抑制自噬，而激活 AMPK和 p53信号转导则会促进自噬。在哺乳动物细胞中 ULK1、ULK2、UKL3最为 mTOR的下游，会激活自噬发生的重要复合体 PI3K形成，促进 LC3-I和LC3-II形成，调控自噬的发生。综合目前研究发现，LC3-II、Beclin-1和 P62均可作为自噬发生检测的标志物。
Figure 1. The autophagic process. (Michelle Cicchini, 2014)Upon deprivation of nutrients or growth factors, activation of AMPK and/or inhibition of mTOR lead to activation of ULK, which phosphorylates Beclin-1, leading to VPS34 activation and phagophore formation. ULK functions in a complex with FIP200 and ATG13, whereas VPS34 function requires are gulatory subunit, VPS15(p150), and Beclin-1, which further mediates the association of other regulatory factors such as AMBRA, ATG14, UVRAG, and BIF1. Multiple ATG proteins such as ATG5 and ATG7 constitute two "ubiquitin-like conjugation systems" that catalyze the formation of phosphatidylethanolamine (PE)-conjugated LC3 (LC3-II) and direct its proper incorporation into the phagophore membrane, where it serves as docking site of adaptor proteins (and bound cargos). The closure of an elongated phagophore marks the formation of a mature autophagosome, which eventually fuses with a lysosome, leading to cargo degradation and recycling of nutrients and metabolites.
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