武汉云克隆科技股份有限公司

2020年 7月，来自广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室钟南山院士团队的蒋义国课题组在“Environment International”上发表了文章“Circular RNA circBbs9 promotes PM2.5-induced lung inflammation in mice via NLRP3 inflammasome activation”。文章借用慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型作为研究对象，发现PM2.5通过NLRP3炎症小体激活受circBbs9-miR-30e-5p-Adar通路调控，导致肺部炎症并损伤。本文首次阐明了PM2.5是如何致肺损伤的生物学机制，并为评价PM2.5诱发的肺部炎症和慢性阻塞性肺病加重提供了一个新的指标circBbs9。

在 这 篇 文 章 中，云 克 隆 慢 性 阻 塞 性 肺 病 小 鼠（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD, DSI557Mu01）再次受到科研工作者的认可，荣登优秀国际期刊。

研究介绍       

       暴露在直径小于 2.5μm的细颗粒环境中或者吸收了其他附着在这些颗粒表面的有毒物质，会产生许多炎性疾病。慢性阻塞性肺病（CODP）就是其中之一。非编码 RNA（ncRNAs）在 COPD的病理进展中起着重要的作用。并且，ncRNAs被认为是具有前景的诊断标志物和治疗靶点。但是，ncRNAs 在 PM2.5 引发的COPD中的作用机制鲜有报道。环状 RNA（circRNAs）是 ncRNAs中的一大类。最近，越来越多的研究表明，当暴露于重金属、氧化钕和苯并芘等环境中时，circRNAs具有多种功能以及响应机制。NLRP3参与先天免疫系统抵抗内源性有害物质或环境污染物。环境污染物可以通过炎性小体 NLRP3激活诱导炎症反应和炎症因子释放。在肺组织暴露于碳纳米管和硅后，炎性小体 NLRP3促进 ROS的生成和炎症因子的释放，导致慢性肺纤维化。

       作者首先将正常的和 COPD小鼠暴露在 PM2.5环境中 3个月，使用免疫组化染色来诊断肺部损伤。比较后发现，小鼠暴露在 PM2.5中，肺泡壁会变厚，血管周围可见广泛的中性粒细胞浸润，大量炎性细胞灶出现。COPD小鼠暴露PM2.5中 3个月后肺组织炎症加重。在 PM2.5中 3个月后，所有小鼠的 IL-1β、IL-18和 TNF-ɑ的 mRNA水平均上升并且在 RAW264.7细胞中验证结果相同。这些结果表明 PM2.5暴露在体内外均可引起炎症反应，增加 COPD模型小鼠的肺炎症损伤。此外，在 PM2.5中 3个月后，所有小鼠的炎性小体 NLRP3的表达量均上升，NLRP3炎性体相关基因NLRP3、cleaved-caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平升高，而且 COPD小鼠的炎症反应加剧。作者认为 PM2.5引起的炎症反应是通过炎性小体 NLPR3途径导致的。因此，作者使用 siRNA抑制NLRP3的表达以探究 NLRP3的作用。实验发现 siRNA不影响 caspase-1的表达，但降低了 cleaved caspase-1和炎症因子 IL-18和 IL-1β的含量。这些结果提示 PM2.5诱导的炎症反应和 COPD加重过程可能通过激活炎性小体 NLRP3途径发生的。 

       同样，作者也分析了 circRNAs 在小鼠肺组织中的表达情况。暴露在 PM2.5 之后，COPD 小鼠中有 6718 个circRNAs上调，3543个 circRNAs下调。通过与 NLRP3通路关联，作者选择了 circBbs9进行后续实验。circBbs9在COPD小鼠的肺组织和血液中均高表达，提示着 circBbs9主要参与 PM2.5诱导的 COPD加剧的过程。circBbs9定位在细胞核和细胞质，且以细胞质为主要部位。干扰 circBbs9后，缓解了 RAW264.7细胞中 PM2.5诱导的 NLRP3炎性小体水平的升高。并且，在 RAW264.7细胞中干扰 circBbs9后，炎性小体 NLPR3、IL-1β和 IL-18的 mRNA水平下降。超 量 表 达 circ- Bbs9 后，NLRP3 的 蛋 白 含 量 上 升，NLPR3、IL-1β和 IL-18 的 mRNA 水 平 升 高。这 些 数 据 表 明，circBbs9能够促进 NLRP3激活。 

       作者之后探究 circBbs9是否与 miRNAs结合共同起到生物作用。通过生信分析并结合文献报道，作者选择了miR-30e-5p进行后续实验。研究发现在小鼠肺组织和血液中，miR-30e-5p和 circBbs9的表达呈负相关。它们共同定位在细胞质内。作者进行了双荧光素酶报告基因实验，将 miR-30e-5p分别与 circ-Bbs9野生型和突变型共转染到293T细胞中。结果发现，miR-30e-5p与 circBbs9野生型共转染的荧光强度下降。作者通过体内体外实验均证明，miR-30e-5p参与到 circBbs9的生物学功能之中。之后，在预测的 5个 miR-30e-5p下游靶基因中，作者发现 Adar的抑制通过 miR-30e-5p与 circBbs9的结合而减轻。 

       最后，将 miR-30e-5p 分别和 circBbs9 siRNA、超量表达 circBbs9 共转染到 RAW264.7 中，检测在对照组和PM2.5组中炎性小体 NLRP3相关基因的表达。结果表明，miR-30e-5p-circBbs9-Adar轴可以影响 NLRP3相关基因的表达。这些结果表明，circBbs9通过 miR-30e-5p调控 PM2.5诱导的 NLRP3炎症小体活性和炎症反应。

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