选对蛋白，从容应对实验挑战！
在进行生物药物分析、抗体制备及蛋白功能研究等实验时，重组蛋白无疑是不可或缺的实验工具。不合适的重组蛋白浪费实验经费不说还耽误科研进度。重组蛋白如何选择呢？别着急，贴心的小云整理了一些挑选重组蛋白的窍门，以帮助科研工作者们从容应对各类蛋白实验。 不同的实验类型，对于蛋白性能的要求也不同。根据实验类型，选择性能合适的重组蛋白，轻松获得完美的实验结果。 01 生物药物分析-SPR实验 最近，常常有客户订购重组蛋白用于表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）实验。SPR技术是基于芯片表面折射率变化的新型光学检测技术，能够实时监测生物分子间相互作用，包括DNA与蛋白质之间、蛋白质分子之间、药物与蛋白之间、核酸与核酸之间、抗原与抗体之间以及受体与配体等生物分子之间的相互作用。生物分子间结合/解离引起生物传感器表面质量的增加/降低，折射率会随之变化，因而通过分析反应过程中SPR角度的动态变化可获取生物分子间互作的特异信号。凭借着灵敏度高、准确性好、稳定性高以及重复性好等优势，SPR技术成为近年来最为热门的生物药物分析检测技术之一。以最为常用的CM5传感芯片（羧基化的葡聚糖芯片）为例，配体蛋白以氨基偶联的方式结合到芯片上，选购配体蛋白的小tips如下: 1）高纯度（不低于90%的纯度）。高纯度的蛋白可防止非特异性结合，有效避免因非特异性结合而干扰互作反应分析结果。 2）浓度高，可达到1mg/mL。 3）明确的等电点信息。芯片偶联需将蛋白溶解于pH低于蛋白pI的溶液中，使蛋白表面的净电荷为正，在流经芯片表面时，可以通过静电吸附作用结合到芯片表面的羧基（电荷为负）上。过低的pH会影响蛋白的活性，因此我们应用预富集实验，寻找最适合的pH条件。 4）明确的分子量信息。偶联量的计算需要了解配体与分析物的分子量大小。 5）蛋白buffer不含Tris等含氨基基团的试剂。Tris等含氨基基团的试剂中有大量游离的氨基，浓度远高于蛋白中的氨基，从而使蛋白无法偶联到芯片上。 6）避免沉淀。 02 抗体制备 重组蛋白是一种最为常用的免疫原。将重组蛋白免疫动物，可产生并获得抗体。当制备抗体时，选用重组蛋白需要注意以下方面： 1）选用纯度高的蛋白。蛋白纯度越高，非目的性的免疫性反应就越小，目的抗体在血清中所占的比例就越高，更易制备获得高性能的抗目的蛋白的特异性抗体。 2）选用去标签或仅带His蛋白标签的重组蛋白。为了便于纯化蛋白，重组蛋白通常会带一段标签（如：6His、GST、Myc、MBP、Flag、Fc等）。当标签分子量太大，免疫动物在产生目标蛋白抗体的同时，也会产生标签抗体，影响抗体的特异性。而6His免疫原性弱，产生抗体的几率非常小，免疫动物时可以不用去掉标签。 3）选用市场上已有的商业化重组蛋白产品，且这些产品已被用于抗体制备并有对应的商业化抗体产品面市。这类重组蛋白产品可直接选用，节省时间和精力。 03 蛋白功能研究 蛋白质具有各种各样的生物功能，是生命活动的主要承担。如何选择蛋白产品，用于蛋白功能研究呢？ 1）蛋白序列。建议选择全长重组蛋白或者含有功能区域的蛋白片段。蛋白序列及功能区域序列信息可在uniprot相应网页中找到。 2）生物学功能的验证数据。选择重组蛋白产品用于生物功能研究时，最为关键的在于了解蛋白产品对应生物学功能的验证数据。选购前，可在产品页面或产品说明书中了解详细的验证情况。下面以几种蛋白生物功能为例，一起来看看吧。 ① 促细胞增殖活性 以云克隆活性蛋白产品APA073Hu61 （Active Interleukin 2）为例，将CTLL-2细胞以5000个细胞每孔的细胞密度接种到96孔板中，并添加不同浓度的人重组IL2蛋白。孵育48h后，用倒置显微镜观察细胞（图1），用CCK-8细胞计数试剂盒（IS087, Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖情况（图2），云克隆IL2活性蛋白可明显刺激CTLL-2细胞的增殖。
图1. IL2刺激后CTLL-2细胞的增殖 A. CTLL-2细胞与10ng/mL的IL2共孵育48h；B. CTLL-2细胞孵育48h。
图2. CTLL-2细胞的增殖随IL2的剂量变化曲线 ② 结合活性 以云克隆活性蛋白产品APB886Hu01 （Active Angiotensin I Converting Enzyme 2）为例，用含有0.01% BSA的PBS（pH 7.4）梯度稀释ACE2。将100μL样品移入SP蛋白预包被酶标板中，37℃孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗涤。除去洗液，加入抗ACE2 pAb孵育1h，弃去孔内液体，用PBST洗板3次。用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后，弃去孔内液体，用PBST洗板3次。加入底物溶液后，在37℃下孵育15-25min。最后，向孔中加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。ACE2和SP的结合活性如图3所示，这种作用呈剂量依赖性。
图3. 人ACE2与SP的结合活性 ③ 趋化作用 以云克隆活性蛋白产品APA087Hu01 （Active Monocyte Chemotactic Protein 1 ）为例，将100uL THP-1细胞悬液接种于培养小室上室，不同浓度的MCP-1蛋白（25 ng/mL和50 ng/mL）置于培养小室下室，37℃孵育3h，去除滤膜并在倒置显微镜下观察迁移的THP-1细胞（图4）并计数细胞迁移数（图5），统计MCP-1对THP-1细胞的趋化作用。
图4. MCP-1对THP-1细胞的趋化作用
A. 50ng/mL MCP-1蛋白对THP-1细胞的趋化作用；B. 25ng/mL MCP-1蛋白对THP-1细胞的趋化作用；C.THP-1细胞对照。
图5. MCP-1对THP-1细胞的趋化作用统计图 ④ 酶活性 100℃煮沸10min使IFNg蛋白变性。将重组蛋白PNGase F用反应缓冲液从1000ng/mL开始进行两倍稀释，每个浓度取10μL，再加入10μL变性IFNg蛋白在37℃下反应1h，最后在100℃煮沸5min终止反应，用SDS-PAGE检测结果（图6）。在10μL反应体系中，37℃条件下，1h从10μg变性IFNg中去除超过95%的碳水化合物所需的酶量定义为一个酶活单位。
图6. SDS-PAGE检测IFNg的去糖基化产物 结果显示，37℃条件下，1h从10μg变性IFNg中去除超过95%的碳水化合物所需的PNGase F为2.5ng。 这份重组蛋白挑选攻略是不是很实用呢？关于蛋白产品的选择，如有更好的建议，欢迎在文末留言区留下您的精彩留言。