知悉ELISA实验影响因素，新手也能获得完美的实验结果
提到ELISA实验，相信大家都非常熟悉。尽管ELISA实验操作相对简单，但在实验中总会遇到或多或少的问题，导致实验进展受阻，给实验者带来不少困扰。今天，小云就给大家介绍一下ELISA实验影响因素，希望能够为您的ELISA实验顺利进行保驾护航。
样本因素
样本因素可分为内源性影响因素和外源性影响因素。
一、内源性影响因素
大约40%的人血清样本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果，导致出现假阳性或假阴性的结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和异嗜性抗体等其他物质等。以类风湿因子和补体为例。
1） 类风湿因子：在类风湿患者及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF)，其一般为IgM型，亦有IgG和IgA型，具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。
2） 补体：在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc段的补体C1q结合点暴露出来，使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。
二、外源性影响因素
1） 样本溶血：溶血样本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性，这是由于溶血样本中含有大量过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。所以严重溶血样本不推荐使用。
2） 样本受细菌污染：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的样本同溶血样本一样，亦可产生非特异性显色而出现假阳性而干扰测定结果。
3） 样本保存不当：样本保存时间过长可能因蛋白降解或变性而导致实验结果偏差，为克服上述干扰，ELISA测定的样本宜为新鲜采集。如不能立即测定，1周内测定的样本可存放于4℃，1周后测定的样本应分装低温冻存。样本推荐按使用量分装以避免反复冻融，反复冻融也会导致蛋白降解或变性。冻存后融解的样本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
4） 抗凝剂的干扰：肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。
5） 样本脂肪含量过高：样本中的脂肪含量过高，会干扰抗原抗体反应，造成假阴性。通过冷冻高速离心处理后，高脂样本会分层，取样时应避免吸取上层脂肪层，取中间澄清段进行检测。
6） 样本的制备：样本的收集时间、处理方法和保存方式都会影响ELISA实验的结果。小云整理了样本处理方法，供研究者参考。
酶联免疫吸附测定实验（ELISA)常见样本处理方法
http://www.cloud-clone.cn/topic/201804271043087152.html
酶联免疫吸附测定实验（ELISA)特殊样本处理方法
http://www.cloud-clone.cn/topic/201805141347467275.html
试剂因素
一、抗体的纯度、亲和力、滴度和特异性
抗体是ELISA测定最为核心的原料之一，抗体的品质决定着ELISA测定的准确性。选择纯度高、亲和力强及特异性强的抗体，可以有效提高试剂盒的灵敏度和特异性，且能保障检测的准确性。
二、标准品定值的准确性
标准品定值是定量ELISA测定最为关键的因素之一，其中标准品定值的准确性决定了ELISA定量测定的准确性。需选用纯度高，稳定性好的抗原物，并精准定量，以确保ELISA定量测定的有效性。
三、标记物的活性
ELISA反应中常用到酶标记物、生物素标记物或荧光标记物等。受检样本中靶物质的量与固相载体上标记物的量呈正比例或反比例关系，根据信号值（酶催化有色产物呈色深浅或荧光信号）进行定性或定量分析。标记物的活性，可放大反应效果，从而提高ELISA测定的灵敏度。
操作因素
以云克隆ELISA试剂盒产品为例，小云整理了操作tips和Trouble shooting。
一、操作tips
1） 试剂准备
① 标准品倍比稀释及样本的稀释不推荐在板孔中进行，避免产生气泡；
② 在试剂配置和样本稀释时，尽量避免吸取10uL以下液体，否则会造成误差较大;
③ 用移液器吹打混匀避免产生气泡，避免用力过大将试剂吹出管外；
④ 标准品、检测液A工作液体以及检测液B工作液体需临用前10min配置;
⑤ 配置检测液A/B工作液时，用微量移液器吸取对应量检测液A/B稀释液，不可直接将试剂瓶中的检测液A/B稀释液倾倒出，否则会造成所取液体量不准确;
2） 加样
① 加样时吸头需垂直悬空加入，吸头不要倾斜或接触孔壁或孔底；
② 加不同的样本需要更换吸头，避免交叉污染；
③ 样本数量较多时，需要加快加样速度，整板加样时间最好控制在10min内，避免不同孔间反应时间相差太大，造成结果不准确；
④ 加入检测液A/B工作液以及洗液可以采用多道移液器加样，使用多道移液器加样注意吸头液面平齐，并垂直悬空加样，避免加到孔外或邻孔；
⑤ 加入不同试剂后需要更换新覆膜，避免交叉污染；
1） 温育
① 温育时，需盖上覆膜；
② 温育时，恒温箱需提前预热使温度恒定至37℃；
③ 温育时，酶标板需平放，不要叠放或倾斜；
4） 洗涤
① 温育结束后，取出酶标板，撕去覆膜，注意不要用力过猛，导致孔内液体溅出，污染邻孔；
② 甩板时应垂直，以免不同孔间液体交叉污染，甩板时尽量将孔内液体甩干净；
③ 使用洗板机，洗板前后，洗板机应用去离子水清洗几遍，洗板过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况；
④ 无洗板机，可用多道移液器进行洗板，洗板后需尽快进入下一步操作，避免酶标板空板时间过长；
5） 显色
显色需在37℃避光显色，显色过程中每隔5min观察颜色变化，以便及时终止，显色时间推荐控制在10-20min内，如颜色较深，可提前终止。如显色20min颜色梯度仍然不明显，可延长显色时间至30min，不要超过30min。
6） 读数
提前打开酶标仪预热，加入终止液需立即450nm读数，读数前确保孔内无气泡以及板底无水滴；
二、操作Trouble shooting
综上所述，在ELISA测定中存在着各种影响检测结果的干扰因素，要从多方面进行分析，除试剂因素和操作因素之外，更多的应从样本因素方面进行分析，并采取相应措施排除干扰作用，以获得正确可靠的检测结果。