亲环蛋白A精确调控IL-1β介导的炎症反应

      亲环蛋白A(cyclophilin A,CypA)是人类细胞中首个发现具有肽基脯氨酸顺反异构酶活性的折叠酶,具有强大的促炎作用,但是有研究者发现它还能抑制炎症反应。2022年5月,《Cell》杂志上发表了一篇题为“Delicate regulation of IL-1β-mediated inflflammation by cyclophilin A”的文章,在这项研究中,研究者发现CypA通过增加白介素1β(IL-1β)的产生促进炎症激活,在炎症消退期促进冗余的pro IL-1β降解和emt介导的肺修复,表明炎症反应的调控复杂而微妙。

       研究者用野生型(WT)和CypA敲除型(Ppia-/-)小鼠建立了脂多糖(LPS)诱导的肺部炎症模型。采用苏木精和伊红染色以及病理评分来评估肺部炎症的严重程度。发现CypA最初促进(治疗后6小时至3天),然后抑制(5至7天)脂多糖诱导的病理性肺损伤。qPCR、ELISA和免疫组化分析的结果也证明这一趋势。回归分析结果显示IL-1β在肺泡灌洗液(BALF)(R2=0.8411)和血清(R2=0.9533)中的表达量与病理评分呈线性关系。(见图1)


图1 CypA通过IL-1β的表达调节脂多糖诱导的肺部炎症。

(图片来源于《Cell》杂志)

       研究者通过ELISA检测ATP刺激炎症小体,在WT的上清液比Ppia-/-的上清液中观察到更多成熟的IL-1β。在免疫印迹实验中,观察到CypA促进了骨髓源巨噬细胞(BMDM)细胞中内源性pro-IL-1β的降解。MG132抑制了pro-IL-1β的降解,说明pro-IL-1β是通过泛素-蛋白酶体途径降解的。接着,研究者采用质谱法鉴定出pro-IL-1β的三个潜在泛素化位点(K73、K132和K143),K73R、K132R和K143R突变会导致K48-linked pro-IL-1β泛素化水平降低,而K132R和K143R突变会导致K63-linked pro-IL-1β泛素化水平降低。将NLRP3、ASC和caspase-1共转染到293T细胞中,用ATP刺激60min,研究者发现K143R突变时,IL-1β表达量显著降低,说明K143R阻止了pro IL-1b分裂成活性的IL-1b,表明K143是pro-IL-1β加工的关键位点。(见图2)

图2 CypA通过调节K48-linked和K63-linked泛素化来促进前IL-1β的加工和降解。

(图片来源于《Cell》杂志)

       通过免疫共沉淀法检测E3连接酶与pro-IL-1β或CypA的相互作用,结果显示,E3连接酶AIP4、RNF5、RNF125和Smurf1与pro-IL-1β相互作用,Smurf1和AIP4与CypA相互作用。然后,研究者通过实验发现只有Smurf会促进pro-IL-1β的裂解,并促进CypA调节的pro-IL-1β降解。泛素化分析显示,CypA促进了Smurf1介导的pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。此外,CypA能够增加293T细胞和BMDMs中Smurf1和pro-IL-1β之间的相互作用,这表明CypA通过增强Smurf1与pro-IL-1β的结合促进了pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。(见图3)

图3 Smurf1参与了Cypa调控的K48-linked和K63-linked pro IL-1β泛素化。

(图片来源于《Cell》杂志)

       研究者构建了IL-1β引发的小鼠肺炎症模型。WT和Ppia-/-小鼠分别用IL-1β处理不同时间。苏木精和伊红染色结果、病理评分、肺指数和干湿块显示,WT小鼠在处理后1天出现严重的肺损伤,处理后7d观察肺损伤减轻情况,WT小鼠上述各项指标在各时间点均显著高于Ppia-/-小鼠。随后,研究者通过ELISA检测了CypA对细胞因子产生的影响,发现CypA增加了IL-1β处理小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生。(见图4)


图4 CypA加重了IL-1β触发的细胞因子的产生和肺损伤。

(图片来源于《Cell》杂志)

       研究者接着研究了CypA在IL-1β触发的II型EMT中的作用。肺切片染色结果显示,在IL-1β处理后7天,WT小鼠的肺纤维化程度和评分明显高于Ppia-/-小鼠。检测了CypA对IL-1β刺激的人II型肺泡上皮细胞系(A549)细胞迁移和侵袭能力的影响,发现CypA促进了细胞迁移和侵袭。接下来研究CypA是否对EMT的关键分子特征有影响。WT和Ppia-/-小鼠肺组织免疫荧光组化检测显示,CypA显著增加β-catenin和α-SMA表达,但降低E-cadherin表达,WB在A549细胞中证实。提示CypA可促进II型肺EMT,促进肺修复。(见图5)

图5 CypA促进IL-1β触发的EMT进行肺修复。

(图片来源于《Cell》杂志)

        对IL-1β处理的A549/WT和A549/CypA细胞进行了转录组和蛋白质组综合分析。与A549/CypA细胞相比,A549/WT细胞中E-cadherin下调,Zeb1、N-cadherin和β-catenin上调。差异基因和蛋白质的功能分析显示,ILK和AKT可能通过ILK/AKT信号通路与Cypa调控的EMT相关。用IL-1β对A549和A549/CypA细胞进行不同时间的刺激,以检测CypA对ILK/AKT信号通路的影响。WB结果显示,CypA对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、ILK和AKT的磷酸化水平均有显著的提高,提示CypA参与了ILK/AKT信号通路的上调。此外,观察到CypA能够与ILK相互作用,并进一步增强293T细胞和A549细胞中ILK与AKT之间的相互作用。这些数据表明,CypA通过靶向ILK促进IL-1β诱导的EMT。(见图6)


图6 CypA通过ILK/AKT途径促进IL-1β诱导的EMT。

(图片来源于《Cell》杂志)

       泛素化分析显示,CypA促进了K63-linked ILK泛素化,而不是K48-linked ILK泛素化,去泛素化酶Cyld参与了CypA对K63-linked ILK泛素化的调控。此外,研究者发现CypA可以抑制A549细胞中Cyld和ILK的相互作用。共免疫沉淀实验表明,CypA过表达时Cyld-ILK相互作用减弱,表明CypA和Cyld相互竞争ILK相互作用。质谱分析发现了5个ILK泛素化位点(K141、K154、K165、K209和K435)。在这些位点中,只有K141或K154突变导致了ILK的K63-linked泛素化降低和ILK-AKT相互作用中断。CypA抑制Cyld介导的K141和K154位点 K63-linked ILK 的去泛素化,然后增加ILK-AKT的相互作用,从而上调ILK/AKT通路,促进IL-1β触发的EMT。(见图7)


图7 CypA抑制Cyld介导的,K63连接的ILK去泛素化。

(图片来源于《Cell》杂志)

       总的来说,这些发现表明,CypA不仅促进炎症激活,还能促进炎症消退。因此,在炎症激活阶段阻断CypA是一种潜在的抗炎策略。同时,在考虑使用CypA阻断治疗炎症时,也不能采取“一刀切”的阻断CypA。

 

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