• 什么是中和抗体,该怎么检测?

    最近,在新冠疫情中想必大家总是听到一个专有名词——中和抗体,它是什么呢?和普通抗体有什么区别呢?在病毒学中,中和抗体(Nautralizing Antibody, )首先是抗体,它在抗体这个层面上和普通抗体的概念重合,是机体免疫细胞被抗原激活后,由B淋巴细胞分化的浆细胞分泌的,能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。除此之外,中和抗体显然还应该有专门针对“中和”的更进一层的含义,这里的中和是指该抗体能和病毒结合,进而阻断病毒感染。这种阻断能力主要通过三种方式来实现:1.阻断病毒与细胞表面受体的结合;2.阻断病毒侵入细胞;3.阻......

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  • 活性蛋白——IFN-γ的细胞刺激实验

    干扰素γ(IFN-gama)是一种多功能蛋白,IFN-γ由T淋巴细胞和NK细胞产生,它既是一种高效的抗病毒生物活性物质,又是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子。IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞,刺激血管内皮细胞和白细胞合成的黏附分子,促进Th1细胞发育并抑制Th2细胞活化与增殖。实验方案:据报道,IFNγ是人单核THP1细胞的重要激活因子。因此,我们选用THP-1细胞作为待刺激细胞,用不同浓度的IFNγ与THP1细胞在RPMI-1640培养基中共培养5天,在显微镜下每天观察THP-1细胞的形态。实验结果:A.THP1细胞在RPMI-1640培养基中以5ng/ml IFN-γ......

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  • 肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶活性实验

    肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase, PAM)是多种多肽产生生物活性所必需的酶。它含有两个具有催化活性的酶活性域:肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)和肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶(PAL)。这些催化结构域依次作用于将神经内分泌肽催化为活性的α-酰胺化产物。通常,将Dns-Tyr-Val-Gly底物水解为Dns-Tyr-Val-NH2作为PAM的典型活性测定法。实验方法:1.在1mL含100mM MES / KOH(pH 6.0)、30mM KI,30mM KCl,1μmol/ L硫酸铜,100ug / mL过氧化氢酶,1%(v / v)乙醇,0.001%(v /......

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  • PNGase F活性测定

    实验原理肽-N-糖苷酶F(PNGase F),可以在N-连接糖蛋白的高甘露糖、杂合和复合寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺和天冬酰胺残基之间进行切割。本试验以真核表达的重组Interferon Gamma(IFNg)蛋白为底物来测定重组肽-N-糖苷酶F的活性。实验试剂及仪器试剂:10×变性缓冲液:5% SDS,400mM DTT反应缓冲液:50mmol/L Tris(pH7.4),150mM NaCl,1% NP-40仪器:SDS-PAGE电泳仪实验步骤将真核蛋白Interferon Gamma(IFNg)用1×变性缓冲液稀释成1μg/μL,在100℃煮沸10min使其变性。将重组蛋白PNGase F用反应缓冲液从1000ng/mL开始进行两倍稀......

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  • 蛋白活性实验-SOD3活性蛋白

    实验原理Superoxide Dismutase 3, Extracellular (SOD3),是SOD同工酶的一种。SOD3以Cu2+、Zn2+为辅基,属于CuZn SOD,可以消除体内代谢产生的反应氧族,抵御内外环境中超氧离子的损伤。由于超氧阴离子自由基O2 - 寿命短,不稳定,不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。本实验采用邻苯三酚自氧化法来间接测定,SOD的活性。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化,生成有色中间产物,在325nm下吸光值增加,加入SOD酶后能抑制其自氧化的速率,从而间接测定SOD酶的活性。实验试剂及仪器试剂:50mmol/L Tris-HCl,pH8.250mmol/L 邻苯三酚......

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  • Caspase-3活性检测

    实验原理Caspase-3是一种蛋白酶,属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族,在细胞凋亡中起着不可替代的作用。caspase-3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中,它既可被Fas/FasL途径活化,也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶,是哺乳动物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶,它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的XXD序列,并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特异性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成对硝基苯胺,通过......

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  • 谷胱甘肽巯基转移酶(GSTp)活性检测

    实验原理:Glutathione S Transferase Pi (GSTp)谷胱甘肽巯基转移酶是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。它能催化机体内有害极性化合物与谷胱甘肽结合,防止DNA损害,还可以由非酶结合方式将体内各种潜在毒性化学药物从体内排出。GSTp能催化内源性谷胱甘肽与1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)结合形成2,4-二硝基苯-谷胱甘肽复合物,在340nm处有吸收峰。因此,测定产物生成量可反映GSTp的活性。试剂:100mM NaH2PO4 缓冲液,pH7.0200mM L-谷胱甘肽(还原型)100mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)实验步骤......

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  • 免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作流程

    样本裂解液的制备1. 细胞裂解液的制备1)收集细胞:将细胞悬液(悬浮细胞直接收集,贴壁细胞可以用细胞刮或者胰酶消化后收集)收集于离心管中,4℃ 1500rpm离心5min后收集细胞沉淀;用预冷的1×PBS洗涤细胞2次,收集细胞沉淀。2)裂解细胞:向细胞沉淀中加入提前预冷的裂解液(裂解液在临用前加入蛋白酶抑制剂),用枪头将细胞团块吹散,放要床上冰上裂解30min(如果细胞溶解不完全,冰上短时超声裂解1-2min)。3)4℃10000rpm离心10min,取适量上清测蛋白浓度,剩余上清根据需求分装与1.5ml EP管中,置于-80℃冰箱保存。2. 组织样本裂......

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