CCK-8法细胞活性及细胞增殖检测实验流程
一 实验材料及试剂
96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微量移液器、酶标仪、CCK-8试剂盒等。
二 实验步骤
1. 取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，每孔100ul加入96孔细胞培养板中。通常细胞增殖实验每孔加入2×103个/100ul 细胞，细胞毒性实验每孔加入5×103个细胞/100ul （具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-4小时等细胞贴壁后再开展实验，如果是悬浮细胞，不需要预培养。
2. 根据实验需求，在培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时间。如果是做细胞毒性试验，加入毒性物质后的培养时间需要摸索。要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。
3. 将试剂盒中的CCK-8溶液取10ul加入96孔细胞培养板，在37℃培养箱中继续孵育0.5-4小时。
4. 测定吸光度。建议采用双波长进行测定，检测波长430-490nm，参比波长600-650nm，或者采用450nm单波长检测。
三 注意事项
1. 如果细胞起始的培养体积为200ul，则需加入20ul的CCK-8溶液，其它情况以此类推。
2. 建议每个药物浓度孔设置3个复制孔，最后取均值做曲线。
3. 设计好实验对照，尽量排除其它因素的干扰：
1）空白对照：可以用加了等量细胞培养液、CCK-8溶液和药物但没有加细胞的孔；
2）阴性对照：不加药物但加了药物溶剂的细胞孔。
4. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可能会干扰检测，需设法去除（加入CCK-8溶液之前更换新鲜培养基，去掉药物影响。如果药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可）。
5. 加入CCK-8溶液后注意孵育时间。对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
7. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液终止反应，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会变化太大，一般还是建议立刻检测。
8. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。