免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作流程
样本裂解液的制备
1. 细胞裂解液的制备
1)收集细胞:将细胞悬液(悬浮细胞直接收集,贴壁细胞可以用细胞刮或者胰酶消化后收集)收集于离心管中,4℃ 1500rpm离心5min后收集细胞沉淀;用预冷的1×PBS洗涤细胞2次,收集细胞沉淀。
2)裂解细胞:向细胞沉淀中加入提前预冷的裂解液(裂解液在临用前加入蛋白酶抑制剂),用枪头将细胞团块吹散,放要床上冰上裂解30min(如果细胞溶解不完全,冰上短时超声裂解1-2min)。
3)4℃ 10000rpm离心10min,取适量上清测蛋白浓度,剩余上清根据需求分装与1.5ml EP管中,置于-80℃冰箱保存。
2. 组织样本裂解液的制备
1)解剖实验动物,取组织;在冰盒上用剪刀将组织剪碎,每20~50mg对应加入1mL新鲜配置的预冷裂解液。冰浴条件下玻璃匀浆器研磨样品或者液氮研磨法(如果未完全溶解,可以短时超声裂解1-2min)。
2)4℃ 10000rpm离心10min,取适量上清测蛋白浓度,剩余上清根据需求分装与1.5ml EP管中,置于-80℃冰箱保存。
抗原抗体免疫沉淀步骤
1. 根据需求取适量的已准备好的样本裂解液300-400ul到1.5mL EP管中,加入约等体积的含蛋白酶抑制剂的1×PBS,混匀,冰上操作。
2. 加入1-5ug抗体到样本裂解液中(阴性对照用和一抗同种属来源的IgG),4℃旋转过夜。
3. 取一定量的洗涤好的protein A/G-beads(根据抗体的亚型选择Protein A或G,一般50ul左右),分别加入到不同的抗原-抗体混合物的EP管中,4℃旋转4h。
4. 免疫沉淀反应后,4℃ 以1000rpm速度离心3 min,弃去上清;然后用洗液洗涤沉淀3次,每次5min;最后一次洗涤留30μl洗液。
5. 向每个EP管中加入30μl的2×加样缓冲液,沸水煮5min。
6. 4℃ 10000rpm离心5min,将离心后的上清转移到新的EP管中并做好编号,直接上样进行SDS-PAGE和Western Blot检测。
SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析
SDS-PAGE电泳和WB检测步骤,请参考:http://www.cloud-clone.cn/topic/201804280916369609.html。