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前面小云有介绍衰老与睡眠障碍之间的关系，由此可以看出睡眠对于人体健康起着至关重要的作用。据调查，我国有超3亿人存在睡眠障碍，失眠发生率高达38.2%。在小鼠和人类中，睡眠量受遗传因素的制约，并表现出与年龄有关的变化，但对于调节哺乳动物睡眠时间的核心分子途径和效应机制仍不清楚。

  北京生命科学研究所刘清华团队通过对小鼠的研究，发现了调控小鼠睡眠时间的关键信号通路，阐明了睡眠时间受转录调控的分子机制，帮助人们理解人类的睡眠异常现象，并为修复或调整睡眠提供指导。相关论文于2022年12月7日发表在《Nature》杂志上。

研究人员通过用重组AAV-PHP.eB病毒对Lkb1^flox/flox成年小鼠进行眼眶后注射，建立脑嵌合体（ABC）模型（含有人突触素（hSyn）启动子的Cre重组酶表达系统），并对成年鼠脑嵌合体的Lkb1基因（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因）进行敲除（ABC-Lkb1^KO）。HA-Cre（含血凝素标签蛋白的Cre）和LKB1的免疫染色证实了在ABC-Lkb1^KO小鼠的不同脑区，有60-99%的表达Cre的神经元出现了LKB1表达的缺失。通过免疫印迹发现，与表达mCherry（红色荧光蛋白）的Lkb1^flox/flox小鼠相比，表达Cre的ABC-Lkb1^KO小鼠的皮层裂解物中LKB1蛋白的水平降低了约75%，同时睡眠时间也减少了3小时以上。这说明LKB1是促进睡眠的蛋白激酶（图1）。

与此同时，研究人员观察到，敲除Lkb1后，小鼠大脑SIK3（盐诱导激酶3，能磷酸化 组蛋白脱乙酰基酶4（HDAC4））的Thr221（T221）磷酸化水平下降约50%，而在携带模拟磷酸化的T221E突变的小鼠中持续激活SIK3蛋白能够部分恢复因LKB1缺失而减少的睡眠时间，这意味着LKB1-SIK3激酶级联促进睡眠。SIK3通过对HDAC4的S245或HDAC5的等效残基的磷酸化和细胞质隔离抑制HDAC4/5活性。研究人员构建了将HDAC4/5的N-末端转录因子结合结构域（H4N/H5N）与VP16的反式激活结构域结合的融合蛋白（H4N-VP16/H5N-VP16），可以干扰培养细胞中内源性HDAC4/5的转录活性。H4N-VP16和H5N-VP16的ABC共表达完全恢复了ABC-Lkb1^KO 小鼠中的NREMS量和δ功率（衡量睡眠深度的标准）。结果表明LKB1-SIK3通路通过抑制HDAC4/5的活性来促进睡眠。

图1. LKB1-SIK3信号通过抑制HDAC4/5调节非快动眼睡眠（NREMS）

为了确定HDAC4/5在小鼠大脑中调节睡眠的位置，研究人员在C57BL/6J小鼠的丘脑（THA）、视前区（POA）或下丘脑后部（PH）立体定向注射AAV-hSyn-HDAC4^CN（CN：细胞核）或AAV-hSyn-H4N/H5N-VP16。通过睡眠-觉醒的视频分析，由AAV介导的HDAC4（CN）或H4N-VP16/H5N-VP16在THA或POA中的表达，没有观察到睡眠表型。相比之下，在下丘脑后部HDAC4（CN）的表达减少了每日睡眠量，H4N-VP16/H5N-VP16的表达显著增加了每日睡眠量。结果表明，HDAC4/5在下丘脑后部调控睡眠时间，并且可能在全新的调控睡眠-觉醒脑区发挥功能。HDAC4/5不能直接与DNA结合，其通过调节多种转录因子（包括：MEF2、FOXO和CREB）的活性来发挥转录调节功能。研究人员通过筛选发现，与HDAC4/5相关的转录因子CREB也能抑制睡眠。为了研究HDAC4和CREB之间的功能关系，研究人员通过在C57BL/6J小鼠中HDAC4（CN）和A-CREB（CREB转录活性抑制剂）的ABC共表达进行上位性分析。血凝素、T7（蛋白标签）和NeuN（能特异性的与神经元细胞核的抗原结合，在正常脑组织的椎体神经元和颗粒性神经元表达）的共免疫染色显示，小鼠大脑中70%至90%的AAV转导神经元共表达HDAC4（CN）-HA和A-CREB-T7。 与ABC-HDAC4（CN）和mCherry的ABC共表达相比，HDAC4（CN）和A-CREB的ABC共表达导致每日NREMS量平均增加约318分钟，而不改变NREMS的δ功率，因此，HDAC4（CN）依赖CREB调节NREMS量（图2）。

图2. HDAC4（CN）以CREB依赖的方式调节NREMS量

接下来，通过转录组分析和ChIP-seq分析发现，HDAC4和CREB可能结合在相同靶基因的同一位置，并且同向调控其转录水平。研究人员在Sleepy突变小鼠中表达HDAC4^CN或CREB均能回补其嗜睡表型，同时也能恢复其转录变化，这说明HDAC4/5和CREB位于SIK3激酶下游协同调节睡眠。这一研究结果首次揭示了调控小鼠睡眠时间的核心分子通路：LKB1-SIK3-HDAC4/5-CREB（图3）。

图3. 调控睡眠的分子通路模型

现今，睡眠问题越来越年轻化，已然成为全球尤为关注的问题，了解睡眠的调控机制可以帮助我们理解睡眠缺陷与睡眠疾病，并能做出对应的诊断和治疗。

云克隆开发了上述研究中涉及到的相关靶标产品，靶标及核心货号如下，供参考：