心脏能再生？快用心缺血再灌注模型验证下吧！
2023年9月27日，德国巴特瑙海姆马克斯·普朗克心肺研究所的研究团队在《Nature》期刊发表了题为“Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice”的文章。该研究表明：抑制小鼠心肌细胞中脂肪酸氧化可提高对缺氧的抵抗力，刺激心肌细胞增殖，从而使缺血-再灌注损伤后的心脏再生。
大部分动物的成体心脏之所以丧失再生能力，主要是因为在出生后不久，大多数心肌细胞退出细胞周期，肥大性生长。与此同时，心脏的心肌细胞能量代谢从糖酵解转向脂肪酸氧化代谢，因为脂肪酸氧化这种氧化代谢方式产生能量的效率更高。由于高代谢活性，心肌细胞在出生后成熟伴随着氧化DNA损伤，这也使心肌细胞难以分裂。因此，一旦发生心肌损伤，原有的心肌组织被瘢痕组织替代，就会导致心脏功能的永久性丧失。
研究团队希望从能量代谢方式的转变中寻找心脏再生的方法，故构建了αMHC-Cre pos/+;Cpt1b fl/fl小鼠（简称Cpt1b cKO），该模型中Cpt1b在胚胎阶段的心肌细胞中特异性失活，此基因对小鼠的脂肪酸氧化至关重要。之后在Cpt1b基因敲除小鼠上构建了缺血-再灌注（I-R）损伤模型，诱导小鼠心脏病发作。这种I-R损伤模型非常接近于病人接受冠状动脉梗阻而心脏被放置支架的情况。结果表明Cpt1b基因敲除组在I-R手术后4周，心脏功能大幅恢复，达到与损伤前几乎相同的水平。研究者进一步探究了Cpt1b基因失活后心肌细胞增殖背后的机制，在Cpt1b基因失活的小鼠心肌细胞中，α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，αKG）的水平增加了20倍。高水平的αKG导致KDM5酶活性显著增加。激活KDM5能去甲基化心肌细胞识别基因，从而恢复这些基因的活性和表达，促进心肌细胞增殖。
这项科学突破，有望为心肌梗死等心脏病带来全新治疗方法。云克隆构建了与该研究相关的心缺血再灌注小鼠模型，具体模型构建方法如下：
1. 用3%戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发（充分暴露手术区），用碘酒和75％乙醇手术区消毒。
2. 气管插管：麻醉后，夹趾检测无反应即可进行I-R手术。打开外置光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数（呼吸频率110bpm），将气管插管沿声门插入气管，取下小鼠接上呼吸机，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功，即可进行I-R手术。
3. 小鼠采用右侧卧位，用眼科剪在左前肢腋下，用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支（LAD）或所在区域。
4. 结扎冠状动脉：于显微镜下找到LAD走向或可能所在位置，持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘2mm处进针，缝线穿过LAD，以完全阻断LAD血流，阻断LAD血流30min，然后再灌注120min。
5. 关胸：结扎完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口（保证无缝隙、无错位）关闭胸腔，由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。
6. 术后管理：术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，正常饲养。
建模后6小时进行模型鉴定，采用的是EB和TTC双染法，具体实验方法如下：
1. 配制1.5%的Evans Blue染液、1% TTC染液备用。
2. 麻醉小鼠。
3. 将小鼠开胸，迅速在小鼠心脏前降支血管原结扎位置处用7-0带线缝合针进行结扎。
4. 用止血钳小心将升主动脉钳夹，从钳夹处近心端小心缓慢注射Evans Blue 染液（25g小鼠约0.2mL）可观察到小鼠心脏迅速变蓝，结扎线以下变化不明显。
5. 迅速分离出心脏后置于-20或-80 ℃冰箱保存。
6. 按以上步骤收集完所有心脏后，从冰箱中取出心脏，用刀片从心尖部逐层切片，每片约1 mm厚，切 5片。
7. 将切好的心脏片置于TTC染液中避光染色约10~20分钟，取出后在体式显微镜下进行拍照。
EB用于判定缺血区（不能被染成蓝色），TTC染色判定梗死区（不能被染成红色）。TTC染色原理是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲臜，用来表示细胞的活力，是评价脑缺血损伤常用的指标。心缺血再灌注小鼠EB-TTC染色结果图如下：非缺血区呈蓝色；梗死区为白色；而危险区不会被染色，呈现原有的心肌颜色，为红色。
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