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衰老免疫系统重获新生

随着年龄的增长，机体的免疫系统开始衰退，更容易患上癌症、感染病毒等疾病，并且机体对疫苗和癌症免疫疗法的反应也越来越差，这表明在免疫治疗中需要考虑年龄的因素。在本研究中，研究团队发现基于PD-1和CTLA4的癌症免疫疗法不能根除老年小鼠的肿瘤，这种抗肿瘤活性的缺陷与两种已知的与年龄相关的免疫缺陷相关：系统性幼稚CD8⁺ T细胞的丰度减少和树突状细胞（DC）的迁移活性减弱。研究团队确认了一种疫苗佐剂，称为DC高激活剂，它可以纠正老年人的DC迁移缺陷。含有肿瘤抗原和DC高激活因子的疫苗诱导Th1 CD4⁺ T细胞驱动老年小鼠的抗肿瘤免疫。当在生命早期使用时，DC高激活剂是唯一确定的可诱导抗肿瘤CD4⁺ T细胞持续到老年的佐剂。这就是近期美国波士顿儿童医院的Jonathan C. Kagan研究团队在《Cell》上发表的题为“Correction of age-associated defects in dendritic cells enables CD4⁺ T cells to eradicate tumors”的研究。

1. 老年小鼠中，CD4⁺ T介导抗肿瘤免疫

研究团队通过评估不同生命年龄段的抗肿瘤反应开始这项研究，在不同年龄（8，20，40，68和92周龄）段小鼠皮下植入表达卵清蛋白（OVA）抗体的B16黑色素瘤细胞（B16OVA）。发现20和40周龄小鼠的肿瘤大小和8周龄小鼠一致，68和92周龄的小鼠的肿瘤生长速度超过了年轻的小鼠。抗PD-1治疗8、20和40周龄小鼠的B16OVA肿瘤对小鼠存活具有保护作用，而对68和92周龄小鼠并无保护作用。研究团队使用B16OVA肿瘤裂解物（whole-tumor lysates，WTLs）配合不同DC刺激佐剂治疗肿瘤，这些佐剂包括LPS、LPS+铝（Alum）、LPS+1-棕榈酰-2-戊二酰磷脂酰胆碱（PGPC），发现只有LPS+PGPC佐剂可以在年轻和老龄小鼠中同时诱导肿瘤消退。这些结果表明，含有DC高激活剂的疫苗可诱导老年小鼠的抗肿瘤免疫。接下来检测CD4⁺和CD8⁺ T细胞在抗肿瘤免疫中的作用，通过中和抗体消耗CD4⁺或CD8⁺ T细胞，发现老龄小鼠中，中和抗体介导的CD4⁺ T细胞缺失，而非CD8⁺ T细胞缺失，废除WTL+LPS+PGPC疫苗疗法的肿瘤治疗效果。

图1. DC高激活剂纠正老年小鼠缺陷T细胞介导的抗肿瘤免疫

2. 老年小鼠中，CD4⁺ T细胞介导抗肿瘤免疫   

CD4⁺ T细胞在老年小鼠抗肿瘤免疫中的重要性提示了接种疫苗后对年龄依赖性的CD4⁺ T细胞功能的检测。为此，通过使用PBS或OVA+LPS+PGPC免疫8周龄和90周龄小鼠后分离皮肤引流淋巴结（dLN）的CD3⁺ T细胞行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。结果发现，年龄因素确实影响T细胞的聚类分布。在PBS处理组，相比于8周龄小鼠CD4⁺ T细胞的初始状态表型（如：Lef1、Satb1、Ccr7、Sell、Igfbp4），90周龄小鼠的CD4⁺ T细胞则表现出混合有炎性（如：S100a4、S100a6、S100a11、Cxcr6、Itgb1、AW112010）和调节性（如：Maf、Ctla2a、Tnfrsf4）的特征；在OVA+LPS+PGPC处理组，相比于8周龄小鼠CD4⁺ T细胞，90周龄小鼠的CD4⁺ T细胞上调基因涉及T细胞的迁移、分化、记忆T细胞活化和调节等方面，值得注意的是，细胞毒性相关分子（如：Eomes、Gzmk、Ctla2a、Ifng、Gzmb、Gzma、Runx3、Nkg7、Cst7、Fcrl6、Slamf7、Cx3cr1、Prf1、Lamp1）在老龄小鼠CD4⁺ T细胞富集。这些数据表明，DC高激活剂在老龄小鼠内诱导CD4⁺ T细胞获得细胞毒作用和抗肿瘤作用。

图2. DC高激活剂在老龄小鼠诱导CD4⁺ T细胞获得细胞毒作用和抗肿瘤作用

3. 炎症小体、IL-1b和DC迁移活性是老年小鼠抗肿瘤免疫的关键因素

在年轻小鼠中，过度活化介导的抗肿瘤免疫依赖于DC的NLRP3炎症小体促进IL-1b的释放，以及DC通过CCR7向dLN的过度迁移。为了评估这些活性是否是老年小鼠的抗肿瘤反应所需要的，研究团队对老年基因敲除鼠（Nlrp3^-/-、Casp1/11^-/-和Ccr7^-/-）评估炎症小体和迁移能力在老年小鼠高活化DC介导的抗肿瘤活性。结果显示相比于老龄WT小鼠，WTL+LPS+PGPC的抗肿瘤效应在老龄敲除小鼠中缺失，表明炎症小体和迁移在老龄高活化DC中的重要性。这些数据说明炎症小体、IL-1b和DC迁移活性在老龄小鼠内介导的抗肿瘤作用。

图3. 老年小鼠抗肿瘤免疫的关键因素

4. DC高激活剂在年轻小鼠诱导CD4⁺ T细胞反应并加强记忆CD4⁺ Th1细胞分化

研究发现与年龄相关的DC功能缺陷可以通过DC高激活剂得到纠正。随后，用不同佐剂免疫，发现OVA+LPS+PGPC免疫佐剂通过CD4⁺ T细胞免疫应答产生最多的IFNg，即LPS+PGPC是最强的诱导Th1反应激活剂，而Th2相关的细胞因子（如：IL-10、IL-4或IL-13）并无增加，进一步研究发现DC高激活剂会加强记忆CD4⁺ Th1细胞分化，且这种效应依赖于炎症小体NLRP3。

图4. DC高激活剂增强Th1细胞CD4⁺ T细胞的再激活加速记忆T的生成

5. DC高激活剂诱导抗原特异性CD4⁺ T细胞持续到老年并发挥抗肿瘤作用

为评估DC高激活剂诱导T细胞免疫应答的长效性，对年轻小鼠（WT和Nlrp3^-/-）进行免疫，发现只有OVA+LPS+PGPC免疫WT小鼠在接种后的一年多时间依然具有抑制肿瘤进展的作用，数据表面DC高激活剂诱导抗原特异性CD4⁺ T细胞的长效性并依然依赖于炎症小体，体外实验进一步证实这一观点。为了确定由DC高激活剂产生的T细胞是否足以提供保护性免疫，研究团队将分离的免疫细胞转移到异源宿主小鼠，同样的免疫途径免疫小鼠后，分离CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、CD19⁺ B细胞、CD14⁺ 单核细胞过继8周龄小鼠，发现只有CD4⁺ T细胞具有最强的抗肿瘤效果，揭示高活化DC诱导长效记忆CD4⁺ T细胞并获得足够的抗肿瘤作用。

图5. 高活化DC诱导长久抗原特异性的CD4⁺ T细胞并发挥抗肿瘤作用

该研究表明，高活化DC可以引发保护性抗原特异性CD4⁺ T细胞反应，并可维持到老年。这或许说明老年群体的免疫缺陷是可以逆转的，为老年人的癌症免疫治疗提供新思路。

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