多因子试剂盒标曲拟合
多因子检测技术是一种基于流式荧光法的多重检测技术，一次实验可同时检测多个靶标分子，适用于蛋白质、小分子、多肽等靶标的检测。相比传统的单因子检测方法，多因子检测技术具有高通量、高灵敏度和特异性好的特点，同时还能节省样本，提高检测效率，有着广泛的应用前景。
流式荧光法多因子检测的免疫学原理与普通酶联免疫吸附实验相似，但信号检测系统有所不同。多因子检测也可以分为双抗夹心和竞争法。双抗夹心法是通过将已知的抗体偶联在荧光微球表面，待测抗原与偶联的抗体反应，加入生物素化的检测抗体，形成双抗夹心的结构，最后加入另一荧光素（以PE为例）标记的链霉亲和素，PE被激发后，测定MFI值（Median Fluorescence Intensity）。MFI值的大小和样品中的靶物质浓度呈正相关。此法多用于IL6、TNFα等大分子蛋白的检测。
竞争法是通过将已知的抗体偶联在荧光微球表面，加入生物素化的抗原和待测抗原，二者竞争结合荧光微球上的偶联抗体。样本中抗原量含量愈多，结合在微球上的生物素化抗原愈少，最后加入PE标记的链霉亲和素，PE被激发后，测定MFI值。小分子激素、药物等靶标的测定多用此法。
标准曲线的绘制和拟合对于多因子检测试剂盒实验的成功至关重要。下面我们以WPS的XLS软件为例，介绍云克隆公司的3因子试剂盒，IS135-Multiplex Assay Kit for IL1b, IL18, BDNF的标曲拟合方法，以供参考。
如图1所示，实验人员按照说明书将标准品从最高浓度（STD1），经倍比稀释至最低浓度（STD6），阴性对照孔为标准品稀释液（STD7）；表格的数值部分是不同浓度标准品的MFI值。图2显示的是IL1b、IL18、BDNF标准品不同梯度的对应的浓度。
图1 标准品对应的MFI值
图2 标准品对应的浓度值
针对这3个靶标，我们分别进行标准曲线的拟合和计算。首先，将IL1b这个靶标各孔的MFI值减去阴性对照孔MFI值，得到校正后的MFI值（如图3所示）；接着，将校正后的MFI值和相应的标准品浓度值分别取对数（以10为底），以Log10（MFI）为X轴，Log10（浓度值）为Y轴，作XY散点图（如图3所示），具体方法如下：选中数据，点击“插入”→“图表”，可以在窗口的右侧看到图表类型，再点击“X Y散点图”，然后得到一条6点曲线（如图5所示）；接着，在该曲线中任选一点以右键打开，选择“添加趋势线格式”，图表上便会弹出一个对话框，可在“类型”选项中选择“多项式（P）”并将“顺序”设定为2阶。最后，在“选项”中勾选“显示公式（E）”和“显示R平方值（R）”（如图6所示），点确定，便会出现标准曲线的对应公式及R2值（如图7所示）。IL18和BDNF的标准曲线制备与上文所述一致。
图3 IL1b标曲数据处理示例图
图4 选择图表
图5 XY散点图
图6 选取下图使用的拟合方式
图7 带拟合公式的标曲示意图
竞争法多因子试剂盒的标曲拟合和双抗法相近，不同之处在于竞争法不需要扣除空白孔MFI值。我们以LMA461Ge，Multiplex Assay Kit for Estradiol 为例进行数据处理部分的演示。如图8所示，MFI值和相应的标准品浓度值分别取对数（以10为底），以Log10（MFI）为X轴，Log10（浓度值）为Y轴，作XY散点图。后续操作和前文所述内容相同，最后可得到如图9所示的标曲。
图8 Estradiol 标曲数据处理示意图
图9 带拟合公式的标曲示意图
最后，我们将多因子检测试剂盒绘制和分析标准曲线过程中常见的问题及相应的解决方案总结如下：
