雄性特异性途径在温度依赖性性别决定中的转录调控
脊椎动物的性别决定系统主要分为基因型性别决定（GSD）和环境性别决定（ESD）。环境性别决定中最突出的形式是温度依赖性性别决定（TSD），在这种情况下，胚胎发育关键阶段（即温度敏感期，TSP）的孵化温度决定了后代的性别。近期，有客户使用多个云克隆ELISA试剂盒（CEA911Ge/CEA540Ge/CEA462Ge/CEA458Ge/CEA443Ge/CEA461Ge）在《Science Bulletin》上发表的相关研究阐明了红耳龟雄性决定途径的调控模式。研究表明红耳龟的温敏类固醇生成细胞（TSSCs）中Ca2+诱导的醛固酮分泌在TSP期间对雄性性别决定起着关键作用；位于前支持细胞中的NR3C1（雄性决定途径的主要调节因子）作为醛固酮受体，对于上调DMRT1（雄性性别决定基因）表达和协调雄性性别决定至关重要。
图1. 龟类温度依赖性雄性性别决定转录调控模式图
（图片源自《Science Bulletin》）
研究者首先从红耳龟在雌性产生温度（FPT，32℃）和雄性产生温度（MPT，26℃）下孵化的个体中分离出胚胎性腺，并将性腺分化期定义为不同的阶段（第16~20阶段）。随后在不同阶段采集发育中的性腺，通过单细胞测序研究其分子和细胞过程。作者发现，到胚胎起始阶段（第15阶段），龟的生殖腺已经包含了单细胞测序鉴定出的所有细胞类型。这表明温度依赖性性别决定机制在生殖腺系统高度分化状态下起作用，这依赖于先前存在的细胞群的进一步特化和重排。
作者发现在单细胞分辨率下，TSSCs主要表达的蛋白种类和其他类型细胞不同，主要是KCNK3、CaV3.2和CaV1.2。从第15阶段到第19阶段TSSCs数量的下降和TSP的持续时间一致，表明TSSCs在温度敏感期起关键作用。此外，基因富集分析（KEGG）和基因本体论（GO）分析结果表明类固醇生成活性是TSSCs的关键功能。
图2. 胚胎性腺单细胞转录组分析
（图片源自《Science Bulletin》）
为了探究细胞内钙离子信号是否调节TSSCs中的醛固酮生成，作者在细胞水平上对KCNK3和CaV通道进行了药理学干预。结果显示，将培养温度从32℃降至26℃特异性地增加了TSSCs中的醛固酮合成，且醛固酮在性腺中呈分泌高峰，而其他类固醇激素则无此现象。阻断KCNK3导致TSSCs产生钙离子内流，且使用选择性醛固酮合成酶抑制剂BI-689648能够有效降低醛固酮水平。表明性腺支持细胞数量的减少可能是导致醛固酮生成存在温度敏感窗口的原因。
图3. TSSCs和性腺中的类固醇生成
（图片源自《Science Bulletin》）
接着，作者就醛固酮的生成发生和雄性性别决定温度之间的关系进行了研究。鉴于在28℃时两性均可发育，作者研究了醛固酮注射是否能促进雄性分化。结果表明，醛固酮的应用显著提高了雄性个体的产量，使性别比例从平衡状态转变为雄性为主。在26℃的全雄性温度下，用BI-689648使雌性比例显著上升。而在32℃醛固酮的应用不能诱导雌性向雄性转变。这些结果支持了由温度-钙离子信号系统调节的TSSCs衍生的醛固酮是雄性性别决定途径中的主要决定因素。
图4. 醛固酮产生增强雄性性别决定
（图片源自《Science Bulletin》）
随后，作者探究了醛固酮在调节支持细胞特化中的作用。通过细胞谱系轨迹分析发现醛固酮对海龟NR3C1的核转位、DNA结合以及转录调控至关重要。在龟类中NR3C1对醛固酮结合以及雄性发育途径中具有重要作用。利用醛固酮受体拮抗剂螺内酯可使NR3C1对DMRT1基因的调节作用降低约70%。此外，NR3C1还能增强ATF1和DMRT1对DMRT1基因的转录激活作用。表明NR3C1、ATF1和DMRT1在DMRT1基因表达中存在协同效应。
为了阐明体内NR3C1的转录调控机制，作者使用螺内酯来探究在全雄性发育温度下通过抑制NR3C1对雄性发育的影响。26℃下螺内酯处理的141个胚胎中，87个生殖腺呈类雌性形态（皮质增厚、髓索退化），其生殖细胞标记物（VASA）和支持细胞标记物（SOX9）阳性细胞的分布也与雌性类似。这些发现表明破坏NR3C1会在全雄性温度下诱导雌性发育，凸显醛固酮结合的NR3C1对雄性发育途径调节的关键作用。
图5. 醛固酮结合NR3C1触发DMRT1表达以确定雄性性别分化
（图片源自《Science Bulletin》）
总之，本研究发现了温度启动TSD物种雄性性别决定的全新雄性特异性途径。为理解龟类雄性决定的分子细胞基础及探索不同进化背景下的TSD模式奠定了基础。
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