武汉云克隆科技股份有限公司

人们普遍认为，生育和哺乳能够降低乳腺癌的长期风险。目前学术界认为，生育通过重塑妊娠期、哺乳期及复旧期乳腺上皮细胞分化与生长通路发挥保护作用，从而随时间推移降低乳腺组织的恶性转化。值得注意的是，哺乳似乎对三阴性乳腺癌（TNBC）的风险降低具有更显著的保护作用。本研究发现，经产会诱导CD8⁺ T细胞在正常乳腺组织中的积聚，其中包括具有组织驻留记忆样表型的细胞。在小鼠模型中，经历妊娠、哺乳及复旧的过程，驱动了CD8⁺ T细胞在乳腺内的积累。这一现象伴随着肿瘤生长减缓及瘤内免疫细胞浸润增加，而清除CD8⁺ T细胞则会消除这些保护效应。重要的是，这种CD8⁺ T细胞依赖性的肿瘤控制作用，仅在完成完整的哺乳及退化复原周期后才被观察到。与此一致的是，经产女性的原发性TNBC组织表现出更强的T细胞浸润和更好的临床预后。这些横跨临床前模型及逾千份患者样本的研究结果，共同揭示了生殖史如何塑造乳腺免疫，确立了CD8⁺ T细胞作为经产相关保护关键介导者的地位，并为乳腺癌的预防和治疗新策略提供了依据。

1. 经产与女性正常乳腺组织中T细胞特征的关联性

为评估生殖史如何影响正常乳腺组织的免疫状态，首先比较了经产与未产女性未患癌乳腺组织中CD8⁺ T细胞的数量和表型。通过对Reed等人整理的四个数据集中的单细胞转录组数据进行分析，发现与未产女性相比，经产女性（≥1次足月妊娠）的CD3⁺、CD8⁺以及CD8⁺织驻留记忆样T细胞（T_RM）的比例显著更高。流式细胞术评估未患癌健康乳腺组织中的免疫浸润情况，发现经产女性表达组织驻留典型标志物CD69和CD103的T_RM样细胞比例显著高于未产女性。多重荧光免疫组化技术进一步证实，经产女性的乳腺组织中CD69⁺CD103⁺CD8⁺ T_RM样细胞群数量显著高于未产女性，这些细胞主要定位于上皮内或导管周围。CD69⁺CD103⁺CD8⁺ T细胞在妊娠后稳定维持超过30年，并且与其CD69⁺CD103⁻CD8⁺ T细胞相比，显示出更优的长期保留，这与先前观察到CD103⁺ T_RM样细胞随时间推移占主导地位的结果一致。为研究与生产和哺乳相关的乳腺相关CD8⁺ T细胞质性差异，在经产乳腺T_RM样细胞中鉴定出差异表达基因，包括上调的ITGAE、ITGA1和CXCR6等，称之为“经产乳腺相关（PB）-T_RM特征”。对包含109例未患癌女性正常乳腺组织样本的独立数据集分析显示，与未产女性相比，经产女性组织中该特征信号呈现显著阳性富集，这证实了生育相关的转录差异。

图1. 经产与女性正常乳腺组织中T细胞特征的关联性

（图片源于《Nature》）

2. 哺乳与复旧促进健康小鼠乳腺脂肪垫中CD8⁺ T细胞的增加

随后研究不同品系（C57BL/6和BALB/c）小鼠在妊娠、哺乳及复旧阶段乳腺脂肪垫（MFP）的免疫细胞群，设置三个实验组：（i）完整自然哺乳周期（21天）后离乳，在乳腺恢复至孕前状态时（复旧后第28天，d28-inv）；（ii）早期强制离乳（FW）复旧，幼鼠在出生12-24小时内移除以实现最低限度哺乳，在复旧后第10天（d10-FW）；（iii）与经产鼠年龄匹配的未生育对照组（virgin），发现d28-inv组CD45⁺细胞总数、CD8⁺ T细胞总数（包括表达CD69⁺CD103^-和CD69⁺CD103⁺的CD8⁺ T细胞亚群）、CD45⁺细胞群中CD44^hiCD8⁺ T细胞数明显高于virgin组。为进一步表征生产相关CD8⁺ T细胞，我们进行了高维蛋白质组学分析。结果显示与virgin组相比，d28-inv组有三个细胞簇显著富集，这三个细胞簇均表达CD69、CD103、CD49a等经典组织驻留标记物。

图2. 哺乳与复旧促进健康小鼠乳腺脂肪垫中CD8⁺ T细胞的增加

（图片源于《Nature》）

3. 哺乳与复旧抑制小鼠乳腺肿瘤生长

为深入探究复旧不同阶段对肿瘤进展的影响，使用TNBC原位癌小鼠模型，对比分析d28-inv、d10-FW小鼠MFP的肿瘤生长情况，并以同龄virgin小鼠作为对照。结果显示，d10-FW组小鼠的肿瘤生长与对照组无差异；而d28-inv组小鼠的肿瘤生长则显著减缓。同时发现d28-inv组肿瘤中CD8⁺ T细胞数量显著增加，包括CD69⁺CD103⁺组织驻留T_RM细胞群，单核细胞、CD4⁺ Th1细胞、树突状细胞及XCR1⁺ I型树突状细胞也有所增加。

图3. 哺乳与复旧抑制小鼠乳腺肿瘤生长

（图片源于《Nature》）

4. 经产诱导的肿瘤保护由CD8⁺ T细胞介导

为探究经产小鼠肿瘤生长减缓是否由T细胞介导，我们在缺乏NK细胞、T细胞和B细胞的RAG2^⁻/⁻γc^⁻/⁻小鼠模型中，对virgin组和d28-inv组小鼠接种AT3-OVA肿瘤细胞，结果显示两组肿瘤生长无显著差异。为验证CD8⁺ T细胞能否重建保护效应，以上两组小鼠分别输注源自OT-I转基因小鼠的初始CD8⁺ T细胞，发现d28-inv组肿瘤生长显著被抑制，且d28-inv组肿瘤内CD45⁺及TCR-vα2⁺CD8⁺ T细胞数量较virgin组升高。进一步验证CD8⁺ T细胞在经产介导保护中的必要性，通过抗体清除CD8α⁺、CD8β⁺或CD4⁺ T细胞发现：单独清除CD8α或CD8β均能显著削弱d28-inv组的抗肿瘤保护，证明CD8αβ⁺ T细胞是关键效应细胞。为评估局部CD8⁺ T细胞是否足以控制肿瘤，研究人员使用S1PR1激动剂——FTY720阻断T细胞向外周迁移，经FTY720处理的d28-inv组小鼠丧失肿瘤保护能力，且肿瘤特异性CD8⁺ T细胞减少。以上数据说明，经产诱导的肿瘤保护由CD8αβ⁺ T细胞介导，哺乳及复旧期后，肿瘤攻击可同时驱动乳腺驻留T细胞扩增与循环肿瘤特异性效应细胞招募，从而增强免疫监视与肿瘤清除能力。

图4. 经产诱导的肿瘤保护由CD8⁺ T细胞介导

（图片源于《Nature》）

5. 母乳喂养与TNBC的免疫细胞浸润相关

在证实小鼠哺乳及复旧后肿瘤生长减缓依赖于CD8⁺ T细胞的基础上，进一步探究在人类TNBC中是否存在类似关联。研究团队分析了包含934名早期乳腺癌女性的马来西亚MyBrCa队列，发现经产且母乳喂养过的女性，其TNBC肿瘤的免疫浸润评分显著高于未生育或未母乳喂养的患者；且之前发现的PB-T_RM特征基因在这些肿瘤中也高度富集，凸显了PB-T_RM特征对生育和复旧的特异性。进一步研究发现，有过哺乳经历的经产女性肿瘤内CD8⁺ T细胞密度显著高于未生育女性。另外比较了拥有哺乳史和生存结局数据的270名澳大利亚女性的独立队列，发现哺乳患者的乳腺癌确诊后总生存期显著长于未哺乳患者，HE染色分析发现哺乳时长最长的个体肿瘤淋巴细胞浸润数量最多。确诊乳腺癌后的总体生存期比未母乳喂养的患者延长近60%（风险比HR=0.39，95% CI：0.19-0.79）。数字病理分析显示，母乳喂养时间越长，肿瘤中的淋巴细胞浸润量越多。

图5. 母乳喂养与TNBC的免疫细胞浸润相关

云克隆开发了涉及上述研究相关靶标的蛋白、抗体以及试剂盒产品，靶标及核心货号如下，供参考：