竞争抑制法ELISA实验操作流程
竞争抑制ELISA实验操作流程
小分子抗原或半抗原因仅有单个抗原表位，缺乏双抗体夹心法所需的基本条件——具有2个或2个以上表位，所以对其常用竞争抑制ELISA进行测定。其原理是将待检抗原和酶标抗原与相应固相抗体竞争结合，标本中抗原越多，与固相抗体结合的酶标抗原越少，与底物反应生成的颜色越浅，因此根据颜色深浅可定量测定。
下面以云克隆竞争抑制法商业试剂盒为例，详细阐述ELISA的操作流程及技术要点，供广大科研工作者参考。
一、试剂准备
1. 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃），如果该试剂盒在一段时间内不能使用，请仅取出本次试验所需的酶标条和试剂，并将剩余的酶标条及试剂按指定的条件保存。
2. 标准品（冻干品）：每瓶标准品加入相应体积标准品稀释液（加入体积以说明书介绍为准），盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动（避免起泡）。准备5个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入600μL的标准品稀释液，如图所示依次三倍稀释，标准品稀释液（0pg/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
图1 标准品三倍稀释示意图
3. 检测溶液A及检测溶液B：Detection A及Detection B在使用前请用手甩几下或短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B 100倍稀释（如：10μL检测溶液A/990μL检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μL/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2mL。
4. 浓洗涤液：580mL蒸馏水或去离子水加入20mL洗涤液（30×）稀释至600mL至工作液浓度。
5. 底物溶液：请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回TMB瓶中。
二、试剂准备注意事项
1. 标准品的稀释不能直接在板中进行。
2. 标准品请于临用前15分钟内配制。该标准品只能使用一次。
3. 标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请使用相应的稀释液配制，稀释液不能混用。用移液枪轻轻吹打充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确性请使用微量吸管，并校准微量移液器。请依据所需的量精确配制，尽量不要使用微量配制的方法（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μL），以避免造成浓度误差。
4. 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液A工作液和检测溶液B工作液。
5. 洗涤液（30x）中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶完全溶解再进行配制。
6. 试剂盒中部分试剂为储存液，客户需配置成工作液后使用，在配置过程中可能因为纯净水质量差或水质污染，以及实验中所用耗材洁净度差，造成实验结果不准确，甚至完全错误。请使用双蒸水配置。
三、操作步骤
1. 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5孔，依次加入50μL不同浓度的标准品（见试剂准备）。空白孔加50μL标准品稀释液，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。
2. 弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用喷射瓶，多道移液器 或自动洗板机来完成。
3. 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。
4. 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤2。
5. 每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色（反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的后面3孔有明显的梯度蓝色，前3孔梯度不明显时，即可终止）。
6. 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
7. 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（O.D.值）。
四、操作步骤注意事项
1. 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2. 加样：实验操作中请使用一次性的灭菌吸头，避免污染。加样时注意不要有气泡产生，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样，加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔尽量小（一般控制在10分钟以内），如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。为了测值的准确性，推荐设置复孔进行实验。
3. 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4. 洗涤：充分洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水，同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机，请在熟练使用后再用于正式实验过程中。
5. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟观察一次），如观察到颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。
6. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。