CRISPR/Cas9和Argonaute基因编辑技术简介
随着科学技术的发展，人们对疾病认识的进一步深入，发现人类很多疾病的发病原因与基因突变有着密不可分的关系。那么如何去治疗这些疾病呢？人们自然想到了采用一些技术手段对突变的基因序列进行重新编辑，以期达到治愈的目的，这项技术就是基因编辑技术。基因编辑技术经过了以归巢酶，ZFN，TALEN等以蛋白质与DNA识别与切割为原理的第一代基因编辑技术的发展，人们对基因编辑技术的认识不断加深，但是由于第一代基因编辑技术操作步骤繁琐、基因编辑效率低下、基因编辑脱靶现象严重等问题，很难应用于生产实践。2003年，MIT小组首次利用原核生物中CRISPR/Cas9 系统对真核生物基因完成了编辑，该技术操作步骤简单、基因编辑效率高、基因编辑脱靶现象不明显等，形成了以CRISPR/Cas9为代表，以RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割为基本原理的第二代基因编辑技术。2016年，韩春雨团队利用原核生物中Argonaute系统，完成对真核生物基因的编辑，该技术相比于CRISPR/Cas9系统操作更为简单、基因编辑效率更高、基因编辑脱靶现象更低、对基因在染色体中所在的位置没有明确要求等，该项技术极有可能成为以DNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割为基本原理的第三代基因编辑技术。下面我们将详细介绍CRISPR/Cas9系统和Argonaute系统为基础的基因编辑技术。
1、CRISPR/Cas9系统为基础的基因编辑技术
CRISPR/Cas9的结构由Cas9的编码区、前导序列和一个由不连续的重复序列R与长度相似的间区序列S间隔排列而成的CRISPR 簇组成，广泛存在于原核生物。在原核生物中，外源的DNA插入到基因组，一旦插入DNA开始转录，生物体会将临近PAM（NGG序列）的序列切割形成短片段，添加到CRISPR 簇中。当相同的外源DNA再次插入时，Cas9会特异性的结合CRISPR 簇中转录出的RNA短片段(引导RNA)，Cas9与RNA结合的复合体会被转运到核内，识别PAM完成对全基因组的扫描，一旦出现能与RNA互补的DNA序列，Cas9将对这段DNA进行剪切，阻断外源DNA的入侵。基于这个原理，只要人为的将CRISPR/Cas9系统通过腺病毒或慢病毒包装等，侵入哺乳动物细胞，根据插入CRISPR簇中的序列（至少与基因组上19个碱基完全匹配）识别剪切的位点，便完成对真核细胞基因组的定点剪切。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB），并在一定条件下引起生物体的主动修复（HDR （同源介导的双链DNA修复）和NHEJ（非同源性末端结合））。
基于CRISPR/Cas9系统的基因敲出实验流程：1、构建含有核定位信号（NLS）的Cas9基因的质粒以及能产生诱导RNA（需提前设计）的质粒；2、包装病毒，滴度检验；3、侵染哺乳动物细胞；4、通过ELISA、WB、荧光实时定量等检测敲除效果。
2、Argonaute系统为基础的基因编辑技术
Argonaute的结构由Argonaute的编码区、5'磷酸化双链短DNA（ssDNA）组成，目前仅在部分原核生物中发现。在真核生物细胞的细胞质基质中基本不存在5'磷酸化的ssDNA，Argonaute通过腺病毒或慢病毒包装、脂质体、电击等，侵入哺乳动物细胞，而5'磷酸化的ssDNA主要通过人工合成直接导入细胞，细胞表达Argonaute会特异性的与5'磷酸化的ssDNA结合，结合产物会被转运到核内，通过ssDNA（最佳为24bp与基因组完全匹配）识别剪切位点，完成对真核细胞基因组的定点剪切。切割完成后，目的位点会出现双链断裂，并在一定条件下引起生物体的主动修复。
基于Argonaute系统的基因敲出实验流程：1、构建含有核定位信号（NLS）的Argonaute基因的质粒以及人工合成ssDNA（需提前设计）；2、将质粒和ssDNA包裹形成脂质体转染染哺乳动物细胞（也可利用电转）；3、通过ELISA、WB、荧光实时定量等检测敲除效果。
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