• 蛋白活性实验-SOD3活性蛋白

    实验原理Superoxide Dismutase 3, Extracellular (SOD3),是SOD同工酶的一种。SOD3以Cu2+、Zn2+为辅基,属于CuZn SOD,可以消除体内代谢产生的反应氧族,抵御内外环境中超氧离子的损伤。由于超氧阴离子自由基O2 - 寿命短,不稳定,不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。本实验采用邻苯三酚自氧化法来间接测定,SOD的活性。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化,生成有色中间产物,在325nm下吸光值增加,加入SOD酶后能抑制其自氧化的速率,从而间接测定SOD酶的活性。实验试剂及仪器试剂:50mmol/L Tris-HCl,pH8.250mmol/L 邻苯三酚......

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  • Caspase-3活性检测

    实验原理Caspase-3是一种蛋白酶,属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族,在细胞凋亡中起着不可替代的作用。caspase-3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中,它既可被Fas/FasL途径活化,也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶,是哺乳动物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶,它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的XXD序列,并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特异性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成对硝基苯胺,通过......

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  • 谷胱甘肽巯基转移酶(GSTp)活性检测

    实验原理:Glutathione S Transferase Pi (GSTp)谷胱甘肽巯基转移酶是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。它能催化机体内有害极性化合物与谷胱甘肽结合,防止DNA损害,还可以由非酶结合方式将体内各种潜在毒性化学药物从体内排出。GSTp能催化内源性谷胱甘肽与1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)结合形成2,4-二硝基苯-谷胱甘肽复合物,在340nm处有吸收峰。因此,测定产物生成量可反映GSTp的活性。试剂:100mM NaH2PO4 缓冲液,pH7.0200mM L-谷胱甘肽(还原型)100mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)实验步骤......

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  • 免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作流程

    样本裂解液的制备1. 细胞裂解液的制备1)收集细胞:将细胞悬液(悬浮细胞直接收集,贴壁细胞可以用细胞刮或者胰酶消化后收集)收集于离心管中,4℃ 1500rpm离心5min后收集细胞沉淀;用预冷的1×PBS洗涤细胞2次,收集细胞沉淀。2)裂解细胞:向细胞沉淀中加入提前预冷的裂解液(裂解液在临用前加入蛋白酶抑制剂),用枪头将细胞团块吹散,放要床上冰上裂解30min(如果细胞溶解不完全,冰上短时超声裂解1-2min)。3)4℃10000rpm离心10min,取适量上清测蛋白浓度,剩余上清根据需求分装与1.5ml EP管中,置于-80℃冰箱保存。2. 组织样本裂......

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  • CCK-8法细胞活性及细胞增殖检测实验流程

    一 实验材料及试剂96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微量移液器、酶标仪、CCK-8试剂盒等。二 实验步骤1.取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液,每孔100ul加入96孔细胞培养板中。通常细胞增殖实验每孔加入2×103个/100ul 细胞,细胞毒性实验每孔加入5×103个细胞/100ul (具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。如果是贴壁细胞,需要37℃培养箱进行预培养2-4小时等细胞贴壁后再开展实验,如果是悬浮细胞,不需要预培养。2.根据实验需求,在培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时......

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  • 流式细胞术检测细胞分子实验步骤

    一、流式细胞术检测细胞胞膜分子1.细胞重悬:细胞处理计数后,用细胞洗液(含2% BSA的PBS)重悬细胞,使细胞浓度为1×107/mL;2.对照设置:空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞,使每管细胞数达到1×106/管;3.一抗孵育:空白对照管不加抗体,同型对照管和待测样本管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体(具体使用量参照说明书),充分混匀,至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管,使细胞和抗体充分反应;4.细胞清洗:加入适量细胞洗液,1000rpm离心5min,弃上清,反复洗涤2次......

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  • 竞争抑制ELISA实验操作流程

    1、酶标板包被抗体流程:1.1按说明书推荐的比例稀释包被抗体,或者设计预实验用倍比稀释的方式稀释包被抗体,酶标孔中加100ul包被抗体包被。酶标板加上覆膜,4℃温育过夜或37℃温育2小时。1.2弃去孔内液体,每孔用350μL的洗涤液洗涤,浸泡1-2分钟。在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。此过程也可采用喷射瓶,多道移液器 或自动洗板机来完成。1.3每孔加入200ul封闭液封闭,37℃温育1.5小时。1.4 弃去孔内液体,甩干,洗板1次,方法同步骤1.2。酶标板包被抗体完成。2、实验流程2.1按说明书推荐的方法稀释成不同浓度的标准品工作液......

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  • 竞争抑制ELISA试剂盒标曲拟合及样本测算方法

    竞争抑制 ELISA ,其主要原理是将标本中的靶分子和一定量的靶分子标记物竞争与酶标板上固相抗体结合。 标本中靶分子量愈多,结合在酶标板上的靶分子标记物愈少,最后的显色也愈浅,也就是说,显色的深浅与样本中靶分子含量成负相关。小分子类激素、小分子药物等 ELISA 测定多用此法。这是因为小分子半抗原或多肽半抗原,缺乏两个以上的抗体结合位点,无法形成双抗体夹心结果,对用竞争抑制法定量检测。如何分析检测数据测算结果呢?在这里为大家推荐一种方法,用EXCEL 软件即可完成结果测算。1、标准曲线拟合方法以云克隆公司的去甲......

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