常规的细胞增殖检测技术

细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物,以分裂的方式产生新个体。多细胞生物,以分裂的方式产生新细胞,从而补充体内衰老或死亡的细胞,有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式。细胞增殖是生物体生长发育、繁殖遗传的基础,所以对细胞增殖的检测一直是一大研究热点。

常规细胞增殖检测技术包括以下几种:

1)标志蛋白的WB检测等。

PCNAProliferating Cell Nuclear Antigen增殖细胞相关的核抗原,在DNA复制以及细胞增殖的启动中起重要作用。Ki67也是一种细胞增殖核抗原,在有丝分裂中维持DNA结构的稳定性,在细胞周期G0期无表达,G1期开始表达,S期和G2期表达量逐渐升高,M期表达量最高,有丝分裂结束后则降解消失。WB实验可对PCNAKi67的表达水平进行检测,从而间接得知细胞增殖情况。

优势:简便性,广泛性,无组织特异性。

劣势:间接反映细胞增殖的情况。

2EdU检测

EdU 5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中。基于EdU与荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性。现多用EdU检测替代BrdU检测。

优势:体外实验,检测灵敏度高,可与多种抗体或荧光蛋白同时标记。

劣势:具有毒性。

(3)CFSE检测法

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种荧光染料,可穿透细胞膜,进入细胞后不可逆的与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上,细胞分裂时,标记荧光平均分配至2个子代细胞中,荧光强度是亲代细胞的一半。利用流式细胞仪的488nm激发光检测。

优势:直接法,活细胞检测。

劣势:CFSE浓度太低,荧光强度不够;浓度太高,毒性影响细胞增殖。

4CCK8检测法。

CCK8检测法是MTT检测法的升级版。CCK8检测试剂中含有WST-8WST-8是一种类似于MTT的化合物,可被线粒体内的脱氢酶还原生成水溶性的甲臜。细胞增殖越多越快,颜色越深。酶联免疫检测仪测定450nm吸光度。

优势:简便,结果直观,活细胞检测。

劣势:间接反映活细胞数量。CCK8试剂颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色相近,不注意的话容易漏加或多加。

云克隆公司现推出了活性蛋白产品,活性蛋白对细胞增殖影响的检测,我们多采用的是CCK8检测法结合镜检观察。如表皮生长因子活性蛋白APA560Hu02,其浓度升高后,可刺激3T3细胞增殖,结果如下:

                                    

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