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蛋白质印迹（Western Blot）是根据抗原抗体特异性结合的原理检测复杂样本中的某种蛋白的方法。将混合抗原样本在凝胶板上进行单向或双向电泳，经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与或标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于鉴定蛋白以及对蛋白进行定性和半定量分析。

蛋白质印迹分为蛋白质分离、蛋白质印迹和蛋白质鉴定三个步骤。每个步骤和环节都可能影响到最终结果, 要想获得理想的实验结果，每个步骤都不能马虎。现就实验中遇到的常见问题进行分析总结，给出解决方案，以提高蛋白质印迹实验的成功率。

一、蛋白质分离-电泳中的问题

蛋白质印迹实验是建立在聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 基础上的，所以蛋白质印迹有些问题是由前期电泳引起的。因此，在此简单介绍电泳中出现的问题。

出现的问题	可能的原因	处理方法	图例
1. “ 微笑”（）形带	凝胶浓度过高； 凝胶中部凝固不均匀，多出现于较厚的凝胶中； 电泳系统温度偏高	选择合适浓度的凝胶；待凝胶充分凝固后再做实 验；水浴降温电泳
‍‍2. “皱眉”（）形 带	装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡。	可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡
3. 拖尾	样品融解效果不佳，分离胶浓度过大引起的	加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂； 重新配制电泳缓冲液；降低凝胶浓度
‍‍‍4. 纹理	样品不溶性颗粒引起的	加样前离心；加适量样品促溶剂
5. 条带偏斜	电极不平衡或者加样位置偏斜	检查电极是否接触良好； 拔梳子的时候动作轻柔，保证加样孔的平坦
6. 条带向两边扩散	加样量过多	样本在上样前先进行蛋白定量，根据具体浓度选择 合适的上样量

二、蛋白质转印-转膜中的问题

转膜是蛋白质印迹实验中关键的一步。转膜不完全和转膜过度都会导致转膜效率低，而导致在检测鉴定时出现信号弱或无信号的情况。优化转膜条件可有效提高转膜效率。

转膜中的常见问题及解决方法：