武汉云克隆科技股份有限公司

原代细胞（Primary Cells）是来源活体组织，经过特定分离方法制备而成的初始细胞。相比于细胞系，原代细胞更多保留了体内原始组织的生物学特征，紧密模拟活体模型，产生更具生理意义的结果，是疾病研究、药物研发和药物筛选等不可或缺的生物工具。

云克隆经过多年的经验积累，反复摸索，提取制备出可供科研人员实验研究的一系列原代细胞。以下，先为大家详细介绍2种代表性的原代细胞的分离制备及不同培养时间的细胞形态：

一、大鼠主动脉内皮细胞：

1. 消化压片法制备大鼠主动脉内皮细胞

1）脱颈法处死2周龄左右大鼠，放入75%的酒精中浸泡消毒5min；

2）快速打开大鼠胸腹腔，分离出主动脉；

                                                                                                                                 图1. 大鼠主动脉

3）去除血管外附着的其他组织；

4）血管内皮翻面；

5）采用消化压片法处理翻转的血管组织；

6）将主动脉剪成小的血管段，加入培养基中进行培养；

7）倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态。

2. 各阶段大鼠主动脉内皮细胞白光拍照

                                                                                                                                 图2 （100x）

                                                                                                                                 图3（100x）                        

                                                                                                                                 图4（200x）

                                                                                                                                 图5（200x）                         

                                                                                                                                 图6（100x）

图2：原代培养第4天的细胞，组织块周边有少量细胞爬出，贴壁细胞呈梭形或多边形；

图3、图4：不同倍数下观察到原代培养第7天的细胞，细胞已长满；

图5：传代后密度低时成典型的“网格状”或“管腔样”结构；

图6：传代后密度高时的呈现类似铺路石的密集细胞群落形态。

二、兔成骨细胞

1. 胰蛋白酶-胶原酶混合消化法制备兔成骨细胞

1）断颈处死新生48h乳兔，放入75%的酒精中浸泡消毒5 min；

2）无菌取出兔颅盖骨，清除骨膜、血管、结缔组织等；

3）将颅盖骨切成碎块用胰蛋白酶预消化；

4）将颅盖骨用胶原酶处理；

5）镜下观察，确定消化处理时间；

6）收集细胞悬液，加入培养基中培养。

2. 各阶段兔成骨细胞白光拍照

                                                                                                                                   图7（100x）                            

                                                                                                                                   图8（100x）

                                                                                                                                   图9（100x）                                

                                                                                                                                   图10（200x）

图7：原代培养第4天细胞已有部分贴壁伸展

图8：原代培养第5天细胞已长满

图9：传代后的兔成骨细胞

图10：传代后的兔成骨细胞

原代细胞可以更好的模拟体内环境，制备原代细胞的目的是要用于后期的生物学研究。那么，原代细胞就必须要有细胞本身的一些特性。

间充质干细胞（MSC）是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞（BMSC）。BMSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

以下，我们来看下云克隆制备的大鼠BMSCs的成骨和成脂分化能力：

一、原代BMSCs的流式鉴定

BMSCs无特异性表面标志，其表面CD29、CD44、CD90、CD105阳性，CD34、CD45阴性。通常选择两个阳性标记一个阴性标记用于鉴定BMSCs细胞，我们选用CD29、CD90、CD45 3个表面标记进行鉴定，结果如下：

                                                                                                                                   图11. BMSCs细胞流式鉴定

二、原代BMSCs的成骨和成脂分化诱导

1、成骨诱导及鉴定

将第3代BMSCs消化，并制成单细胞悬液，接种于6孔板，待细胞贴壁并长满 90%时，加入成骨诱导液，每3d换液一次。成骨诱导分化14d 后，分别进行茜素红染色及碱性磷酸酶染色。

                                                                                                                                   图12. BMSCs成骨诱导后茜素红染色  

                                                                                                                                   图13. BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶染色

2. 成脂诱导及鉴定

将第3代BMSCs消化，并制成单细胞悬液，接种于6孔板，待细胞贴壁并长满 90%时，加入成脂诱导液A，3d后更换成成脂诱导液B, 2天后更换成成脂诱导液A，3天后更换成成脂诱导液B。如此交替作用2-3轮，镜下能看到明显的脂滴，进行油红O染色。

                                                                                                                                  图14. BMSCs成脂诱导后油红O染色

云克隆部分原代细胞展示：