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荧光素酶（luciferase）在一定条件下可以催化荧光素（luciferin），产生自发光现象（如图1）。荧光素或荧光素酶不是特定的分子，而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称。目前比较常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶，海萤荧光素酶等。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成的双报告系统在基因的表达调控、信号通路的转导作用、高通量药物筛选、siRNA和miRNA筛选等多个研究领域发挥重要作用。

                           图1. 荧光素酶与荧光素的发光反应

萤火虫荧光素酶是目前研究中使用最为广泛的荧光素酶。它由550个氨基酸组成，翻译后的蛋白质不需要修饰即可获得酶活性。高浓度酶的累积几乎没有细胞毒性，可用于原核和真核细胞。反应产生荧光的组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白（GFP）。该反应是酶与底物相互反应发光，具有高特异性；荧光产生的过程不需要激发光的存在，几乎没有背景信号，信噪比高。

荧光素酶基因通过基因工程的手段整合到预期观察的细胞染色体DNA上，可表达具有生物活性的荧光素酶，经过一系列筛选和鉴定就能得到稳定表达荧光素酶的细胞株。当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。当外源给予其底物荧光素，在ATP和O₂存在的条件下，可在活细胞内产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。下面以HepG2细胞为例，介绍HepG2-luc稳定细胞系构建的流程。

1 荧光蛋白载体的构建

萤火虫荧光素酶基因通过分子克隆的方式构建到质粒上。

2. 慢病毒转染实验

Ø 取对数生长期HepG2细胞，胰酶消化调整细胞密度为1×10⁵/ml，种于6孔板内，每孔2ml，将6孔板置于培养箱中继续培养，待细胞汇合度达到30 %~40 %时，即可进行慢病毒转染。

Ø 按照MOI=10计算病毒使用量，然后加入相应量的病毒进行转染，每孔添加2ug/ml Polybrene作为助转剂，将6孔板置于培养箱中继续培养。

Ø 感染8-12小时后，更换为新鲜培养基，继续培养72小时。

3. Puromycin抗性筛选

Ø 取上述转染好的细胞，倒置显微镜下观察细胞状态，先用新鲜培养基传代1次，稳定细胞状态后，可添加含有嘌呤霉素的培养基进行培养。

Ø 待细胞汇合度达到70%-80%时，吸弃原培养基，加入含1ug/ml的嘌呤霉素新鲜培养基，继续培养。

Ø 用1ug/ml的嘌呤霉素维持培养3天后，更换为2ug/ml的嘌呤霉素新鲜培养基，继续培养；3天后再更换为5ug/ml的嘌呤霉素新鲜培养基继续培养；3天后再更换为10ug/ml的嘌呤霉素新鲜培养基，继续培养；直至没有病毒感染的对照组细胞全部被Puromycin杀死。

4. 细胞体外生物发光检测

Ø 用蒸馏水溶解D-荧光素钠盐，配制成30mg/ml的储存液（200×）。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。

Ø  用预热好的组织培养基1:200稀释储存液，配制工作液（终浓度150µg/ml）

Ø 去除培养细胞的培养基。

Ø 待图像分析前，向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析

Ø 细胞成像结果展示如下：

图2 HepG2-luc稳定细胞系发光检测

2.  细胞体内活体成像检测：

Ø 裸鼠成瘤：取生长良好的细胞消化后制成细胞悬液，计数后取100μl（含5*106个细胞）的细胞悬液经皮下接种于小鼠，每天正常饮食。

Ø 动物成瘤后即可进行活体成像

Ø 1）用无菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-荧光素钠盐工作液（15mg/ml），0.2µm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。

Ø 2） 注射量取决于注射方式，具体如下：

3） 成瘤的动物 采用腹腔注射即可，注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析（如图3）。

                               图3 成瘤小鼠活体成像检测

云克隆还为客户提供过多种luc稳转细胞系

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