武汉云克隆科技股份有限公司

伤害感受神经是感觉神经系统中专门感受伤害性刺激，传导疼痛信号的神经元。有研究指出伤害感受神经不仅能传导疼痛，在被有害刺激激活后其神经末梢会释放神经肽、神经递质，以此来调节固有免疫细胞和获得性免疫细胞的功能。2022年11月，Nature杂志上发表了一篇题为“Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance”的文章，在这项研究中，研究者发现黑色素瘤细胞与伤害感受神经元相互作用，促进神经突起的生长，神经元释放的神经肽CGRP，使CD8⁺ T细胞衰竭，限制了它们消除黑色素瘤的能力，而去除神经分布，可以激活肿瘤免疫。

研究者最初在黑色素瘤活检组织中观察到伤害感受神经元（TRPV1标记）比相邻的健康组织增加了约两倍，并且活检组织转录组数据中神经元来源基因显著表达。于是建立小鼠模型，将带有GFP的黑色素瘤(B16F10-eGFP)细胞系接种到小鼠中，植入22天后发现肿瘤周围和肿瘤内部有大量的伤害受体神经元，说明黑素瘤促进了神经元轴突生成。接着通过钙通量测量发现伤害受体神经元与B16F10细胞共培养时，辣椒素、异硫氰酸烯丙酯和ATP刺激可以促进反应神经元的数量显著增加。研究人员将背根神经节(DRG)神经元与B16F10细胞共培养96 h，发现神经元在培养基中主动释放降钙素基因相关肽(CGRP)。接着将DRG单独或与B16F10-m Cherry-OVA细胞联合培养48 h后，收集TRPV1⁺伤害受体通过RNA测序，发现编码CGRP的基因Calca和NGF受体Trka过表达。这表明黑色素瘤可以激活伤害受体神经元主动分泌CGRP。(见图1)

研究者设计了一套模拟黑色素瘤微环境的共培养系统，发现黑色素瘤癌细胞与DRG神经元或OVA特异性细胞毒性CD8⁺ T细胞共培养时，黑色素瘤癌细胞中的分泌型白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）过表达，且SLPI在培养基中的分泌效果在48 h后达到最大。接着，研究者用钙显微镜测量SLPI 是否直接激活培养的DRG神经元，发现SLPI(0.01-10 ng/ml)激活了约20%的DRG神经元。另外，用SLPI激活培养的神经元（3小时），还会导致CGRP的显著释放。黑色素瘤分泌的SLPI作用于痛觉感受器，触发钙流入、神经肽释放和热超敏反应，这表明这些感觉神经元检测到癌细胞的存在并作出反应。(见图2)

研究者将B16F10-mCherry-OVA细胞注射到野生型(WT)小鼠的左后爪中，发现肿瘤内CD8⁺ T细胞衰竭与热超敏反应呈正相关。另外，研究人员还将B16F10- mCherry -OVA接种到8周大伤害感受神经元完整或敲除的雄性和雌性小鼠中。在神经元敲除的雄性和雌性小鼠中，中位生存期增加了2.5倍。同时，研究者在肿瘤接种后16天进行分析，发现神经元敲除后肿瘤生长减少而IFNγ⁺ CD8⁺ T细胞的肿瘤浸润增加，PD-1⁺ LAG3⁺ TIM3⁺ CD8⁺ T细胞比例降低，在CD8⁺ T细胞系统性耗损后，两组小鼠之间的肿瘤生长没有显著差异。之后，研究者通过给Rag1^-/-小鼠注射树脂毒素(RTX)，然后接种naive OVA - specific CD8⁺ T细胞，发现肿瘤生长减少和衰竭。这些都说明伤害感受神经元通过促进CD8⁺T细胞衰竭，抑制机体免疫，促进癌细胞生长。（见图3）

WT、CGRP受体敲除型(Ramp1^-/-)和OT-I小鼠在Tc1刺激条件下(体外被CD3和CD28， IL-12和抗IL-4激活)培养48 h，产生细胞毒性CD8⁺ T细胞。接着，在10ng/ml的IL-2中，用CGRP (100 nM，每2天一次)刺激细胞96 h，结果显示PD-1⁺ LAG3⁺ TIM3⁺细胞比例增加，而Ramp1^-/-小鼠中收集的细胞毒性CD8⁺ T细胞没有这些影响。将OT-I细胞毒性CD8⁺ T细胞与B16F10-mCherry-OVA共培养时，研究者发现CGRP刺激会导致B16F10-mCherry-OVA细胞的凋亡减少。在伤害受体消融的小鼠中，研究人员用CGRP处理的小鼠显示出与WT小鼠相似的肿瘤生长和CD8⁺ T细胞衰竭。接下来，研究者用选择性RAMP1拮抗剂BIBN4096 处理荷瘤小鼠，肿瘤生长减少，肿瘤内PD-1⁺ LAG3⁺ TIM3⁺ CD8⁺ T细胞的比例降低，表明BIBN4096的抗肿瘤特性依赖于活跃的伤害感受器神经元。（见图4）

研究者设置了Ramp1^-/-、Ramp1^WT、Ramp1^-/-和Ramp1^WT 混合共三组小鼠模型，分别接种B16F10，10天后在Ramp1^WT移植小鼠中观察到更显著的肿瘤生长，而Ramp1^-/-的小鼠肿瘤生长有限。接着通过免疫表型和RNA测序分析，与Ramp1^WT相比，Ramp1^-/-组PD-1⁺ LAG3⁺ TIM3⁺ CD8⁺ T细胞的比例降低，衰竭标记物的转录本表达减少。研究者发现与伤害受体神经元的其他标记物一样，在这些活检中RAMP1的过表达与患者生存率降低相关。在对黑色素瘤单细胞RNA测序的硅质分析中显示，与Ramp1阴性的CD8⁺ T细胞相比，瘤内表达Ramp1的CD8⁺ T细胞强烈过表达PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4。这些数据说明，CGRP受体RAMP1影响黑素瘤患者中CD8⁺ T细胞的衰竭和对免疫检查点抑制剂（ICI）的临床反应。（见图5）

总的来说，伤害受体神经元的基因敲除可以阻止CD8⁺ T细胞衰竭，减少B16F10肿瘤的生长，而外源性给药CGRP的作用则相反。这为我们提高抗肿瘤免疫力提供了一种新的思路。

云克隆开发了上述研究中涉及的相关指标的蛋白、抗体、ELISA试剂盒等产品以助力肿瘤治疗相关研究，部分指标节选如下，供参考。

更多信息，欢迎访问http://www.cloud-clone.com/。