武汉云克隆科技股份有限公司

技术分享——原代细胞制备、分离、培养、鉴定

 

云克隆原代细胞制备，至今已积累十多年的经验，已制备原代细胞类型包括：软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、星形胶质细胞、上皮细胞、成纤维细胞、小胶质细胞、肌肉细胞、平滑肌细胞、各种干细胞等，制备组织来源包括，如：关节、主动脉、心脏、肺、视网膜、大脑、骨髓、肾脏等。云克隆自有动物中心已获得小动物生产许可证和大、小动物使用许可证，确保我们可提供多种动物来源的原代细胞，如：大鼠、小鼠、兔、猪、羊、犬、马等。

 

图1. Administrative licenses of Clond-Clone animal center

 

以下，分享其中几种有代表性的原代细胞制备经验：

1. 大鼠心肌细胞（Myocardial Cells，MC）原代细胞

1）实验材料

实验动物：1-3日龄SD乳鼠（雌雄不限）

组织来源：心组织

手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

消化酶：胶原酶、胰酶

培养基：DMEM+20%FBS+1%双抗

2）实验步骤

Ø 取刚出生1-3天的乳大鼠，脱颈处死后，放入75%的酒精消毒5min；

Ø 在超净台内无菌取出鼠心组织，放入剩有PBS（含2%双抗）的培养皿内，用眼科剪和眼科镊仔细清除其中的血块；

Ø 用剪刀将组织块切成肉糜状；

Ø 加入胰酶初消化10min后，去除上清；

Ø 再加入胶原酶消化；

Ø 1000rpm，5min，收集沉淀，接种细胞；

Ø 差速贴壁；

Ø 换液培养细胞。

3）相关数据

分离得到大鼠心肌细胞，进行显微镜拍照，如下：

 

图2. Morphology of Rat Myocardial Cells (Optical microscope, x100)

并能看到心肌细胞明显的搏动。

特异性抗体鉴定心肌细胞，如下：

 

图3. IF identification of Actin Alpha 1, Cardiac Muscle (ACTC1) specific antibody  (×200)

 

2. 大鼠三叉神经节神经元（Trigeminal Ganglion Neuron Cells, TGNC）原代细胞

1）实验材料

实验动物：SD大鼠

组织来源：三叉神经节

手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

消化酶：胶原酶、胰酶

培养基：DMEM/F12+10%FBS基础培养基，Neurobasal A+ B27 神经元专用培养基

DMEM/F12

2）实验步骤

Ø 脱颈法处死周龄大鼠（2周左右），放入75%的酒精中浸泡消毒5min；

Ø 剔除神经节周围的血管、脂肪、神经鞘膜等结缔组织，准确分离三叉神经节；

Ø 用直剪将神经节剪成小的组织块，并加入胶原酶、胰酶分布消化；

Ø 过滤，离心，接种并培养细胞；

Ø 换神经元专用培养基培养细胞。

3）相关数据

原代培养第4天，可见大部分贴壁伸展神经元细胞，如下：

 

图4. Morphology of Rat TGNC primary culture in day 4 (×200)

细胞换液，继续培养2天，即原代培养6天，随时间增加，突起变长并交错呈网络，如下：

 

图5. Morphology of Rat TGNC primary culture in day 6 (×200)

特异性抗体鉴定三叉神经节神经元，如下：

 

图6. IF identification of β-Tubulin III specific antibody (×200)

 

3. 小鼠肾皮质上皮细胞（Renal Cortical Epithelial Cells, RCEC）原代细胞

1）实验材料

实验动物：2周龄左右的BALB/C小鼠2只（雌雄不限）

组织来源：肾皮质

手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

消化酶：胶原酶，胰酶

培养基：小鼠肾小管上皮细胞专用培养基

2）实验步骤

Ø 颈椎脱臼法处死小鼠后置于75%酒精，浸泡5min；

Ø 在超净台中无菌取出双肾并用手术刀切取肾皮质；

Ø 用胶原酶和胰酶消化；

Ø 终止消化；

Ø 过滤，离心，重悬沉淀；

Ø 加入肾小管上皮细胞专用培养基培养。

3）相关数据

原代培养第一天，肾小管节段折光性好，状态佳，纯度较高，如下：

 

图7. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 1  (x100)

原代培养4天，肾小管节段消失，有大量上皮细胞样长出，呈岛屿状向四周伸展，如下：

 

图8. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 4  (x100)

原代培养第5天，细胞已长满，如下：

 

图9. Morphology of Mouse RCEC primary culture in day 5 (x100)

传代后的细胞生长良好，如下：

 

图10. Morphology of Mouse RCEC after passage (x100)

特异性抗体鉴定肾皮质上皮细胞，如下：

 

图11. IF identification of Tight Junction Protein 1 (ZO-1) specific antibody (x200)

 

4. 兔皮下脂肪前体细胞（Subcutaneous Preadipocytes, SPrAD）原代细胞

1）实验材料

实验动物: 日本大耳白兔

组织来源：腹股沟部及劲背部皮下脂肪

手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

消化酶：胶原酶

培养基：DMEM/F12+15%FBS+1%双抗

2）实验步骤

Ø 取日本大耳白兔1只，经耳缘静脉注射空气处死，在腹部及劲背部喷酒精消毒；

Ø 取皮下腹股沟部及劲背部脂肪组织；

Ø 将脂肪组织切成碎块，加入胶原酶消化；

Ø 终止消化，离心，留底部沉淀；

Ø 收集底部沉淀，加入完全培养基重悬，过滤，培养。

3）相关数据

各阶段兔皮下脂肪前体细胞培养形态如下：

 

图12. Morphology of Rabbit SPrAD primary culture in day 2 ( ×100)

 

图13. Morphology of Rabbit SPrAD primary culture in day 4 (×100)

传代后的细胞生长良好，如下：

 

图14. Morphology of Rabbit SPrAD after passage (P1) (x100)

前脂肪细胞，或称脂肪间充质干细胞（Mesenchymal adipose cell precursors, ADSCs），与其他成体干细胞一样，具有自我更新、活力持久及多向分化潜能。在合适的诱导条件下，可向多个方向进行细胞分化，如上皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞和肝细胞等。

我们将分离得到的兔皮下脂肪前体细胞分别像成骨细胞和脂肪细胞方向诱导，进行其功能方面验证，诱导完成后，染色结果如下：

 

图15. Alizarin red staining of Rabbit SPrAD after osteogenic induction

 

图16. Oil red O staining of Rabbit SPrAD after adipogenic induction

 

部分原代细胞列表如下：

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List time

Product No.

Product Name

Product Name

UOM

2周

CSI003Ca01

犬关节软骨细胞(AC)原代细胞

Primary Canine Articular Chondrocytes (AC)

5X10^5

2周

CSI003Cp01

山羊关节软骨细胞(AC)原代细胞

Primary Caprine Articular Chondrocytes (AC)

5X10^5

2周

CSI006Ca01

犬主动脉内皮细胞(AEC)原代细胞

Primary Canine Aortic Endothelial Cells (AEC)

5X10^5

2周

CSI007Ca01

犬心肌细胞(MC)原代细胞

Primary Canine Myocardial Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI010Ca01

犬视网膜星形细胞(RA)原代细胞

Primary Canine Retinal Astrocytes (RA)

5X10^5

2周

CSI067Ca01

犬肾皮层上皮细胞(RCEC)原代细胞

Primary Canine Renal Cortical Epithelial Cells (RCEC)

5X10^5

2周

CSI011Ca01

犬脑星形胶质细胞(BA)原代细胞

Primary Canine Brain Astrocytes (BA)

5X10^5

2周

CSI032Ca01

犬皮下脂肪前体细胞(SPrAD)原代细胞

Primary Canine Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD)

5X10^5

2周

CSI034Ca01

犬肺成纤维细胞(PF)原代细胞

Primary Canine Pulmonary Fibroblasts (PF)

5X10^5

2周

CSI061Ca01

犬肾小管上皮细胞(RTEC)原代细胞

Primary Canine Renal  Tubular Epithelial Cells (RTEC)

5X10^5

2周

CSI066Ca01

犬膀胱基质成纤维细胞(BSF)原代细胞

Primary Canine Bladder Stromal Fibroblasts (BSF)

5X10^5

2周

CSI069Ca01

犬气管上皮细胞(TEC)原代细胞

Primary Canine Tracheal Epithelial Cells (TEC)

5X10^5

2周

CSI075Ca01

犬新生儿表皮角形成细胞(NEK)原代细胞

Primary Canine Neonatal Epidermal Keratinocytes (NEK)

5X10^5

2周

CSI083Ca01

犬骨髓间充质干细胞(BMMSCs)原代细胞

Primary Canine Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BMMSCs)

5X10^5

2周

CSI108Ca01

犬食管平滑肌细胞(ESMC)原代细胞

Primary Canine Esophageal Smooth Muscle Cells (ESMC)

5X10^5

2周

CSI094Ca01

犬脾成纤维细胞(SF)原代细胞

Primary Canine Splenic Fibroblasts (SF)

5X10^5

2周

CSI068Ca01

犬气管平滑肌细胞(TSMC)原代细胞

Primary Canine Tracheal Smooth Muscle Cells (TSMC)

5X10^5

2周

CSI081Ca01

犬内脏前脂肪细胞(VPA)原代细胞

Primary Canine Visceral Preadipocytes (VPA)

5X10^5

2周

CSI138Cp01

山羊卵巢成纤维细胞(OF)原代细胞

Primary Caprine Ovarian Fibroblasts (OF)

5X10^5

2周

CSI057Ca01

犬骨骼肌细胞(SkMC)原代细胞

Primary Canine Skeletal Muscle Cells (SkMC)

5X10^5

2周

CSI153Ca01

犬主动脉平滑肌细胞(ASMC)原代细胞

Primary Canine Aortic Smooth Muscle Cells (ASMC)

5X10^5

2周

CSI019Ca01

犬角膜上皮细胞(CEC)原代细胞

Primary Canine Corneal Epithelial Cells (CEC)

5X10^5

2周

CSI114Ca01

犬滑膜细胞(SYC)原代细胞

Primary Canine Synovial Cells (SYC)

5X10^5

2周

CSI164Ca01

犬骨髓单核细胞(BMMC)原代细胞

Primary Canine Bone Marrow Mononuclear Cells (BMMC)

5X10^5

2周

CSI102Ca01

犬成骨细胞(OB)原代细胞

Primary Canine Osteoblasts (OB)

5X10^5

2周

CSI165Ca01

犬外周血单核细胞(PBMC)原代细胞

Primary Canine Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)

5X10^5






2周

CSI003Mu01

小鼠关节软骨细胞(AC)原代细胞

Primary Mouse Articular Chondrocytes (AC)

5X10^5

2周

CSI003Ra01

大鼠关节软骨细胞(AC)原代细胞

Primary Rat Articular Chondrocytes (AC)

5X10^5

2周

CSI003Rb01

兔关节软骨细胞(AC)原代细胞

Primary Rabbit Articular Chondrocytes (AC)

5X10^5

2周

CSI088Ca01

犬新生儿真皮成纤维细胞(NDF)原代细胞

Primary Canine Neonatal Dermal Fibroblasts (NDF)

5X10^5

2周

CSI006Mu01

小鼠主动脉内皮细胞(AEC)原代细胞

Primary Mouse Aortic Endothelial Cells (AEC)

5X10^5

2周

CSI006Ra01

大鼠主动脉内皮细胞(AEC)原代细胞

Primary Rat Aortic Endothelial Cells (AEC)

5X10^5

2周

CSI006Rb01

兔主动脉内皮细胞(AEC)原代细胞

Primary Rabbit Aortic Endothelial Cells (AEC)

5X10^5

2周

CSI007Mu01

小鼠心肌细胞(MC)原代细胞

Primary Mouse Myocardial Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI007Ra01

大鼠心肌细胞(MC)原代细胞

Primary Rat Myocardial Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI007Rb01

兔心肌细胞(MC)原代细胞

Primary Rabbit Myocardial Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI010Mu01

小鼠视网膜星形细胞(RA)原代细胞

Primary Mouse Retinal Astrocytes (RA)

5X10^5

2周

CSI010Ra01

大鼠视网膜星形细胞(RA)原代细胞

Primary Rat Retinal Astrocytes (RA)

5X10^5

2周

CSI010Rb01

兔视网膜星形细胞(RA)原代细胞

Primary Rabbit Retinal Astrocytes (RA)

5X10^5

2周

CSI011Mu01

小鼠脑星形胶质细胞(BA)原代细胞

Primary Mouse Brain Astrocytes (BA)

5X10^5

2周

CSI011Ra01

大鼠脑星形胶质细胞(BA)原代细胞

Primary Rat Brain Astrocytes (BA)

5X10^5

2周

CSI011Rb01

兔脑星形胶质细胞(BA)原代细胞

Primary Rabbit Brain Astrocytes (BA)

5X10^5

2周

CSI032Mu01

小鼠皮下脂肪前体细胞(SPrAD)原代细胞

Primary Mouse Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD)

5X10^5

2周

CSI032Ra01

大鼠皮下脂肪前体细胞(SPrAD)原代细胞

Primary Rat Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD)

5X10^5

2周

CSI032Rb01

兔皮下脂肪前体细胞(SPrAD)原代细胞

Primary Rabbit Subcutaneous Preadipocytes (SPrAD)

5X10^5

2周

CSI034Mu01

小鼠肺成纤维细胞(PF)原代细胞

Primary Mouse Pulmonary Fibroblasts (PF)

5X10^5

2周

CSI034Ra01

大鼠肺成纤维细胞(PF)原代细胞

Primary Rat Pulmonary Fibroblasts (PF)

5X10^5

2周

CSI034Rb01

兔肺成纤维细胞(PF)原代细胞

Primary Rabbit Pulmonary Fibroblasts (PF)

5X10^5

2周

CSI047Mu01

小鼠脑膜细胞(MC)原代细胞

Primary Mouse Meningeal Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI047Ra01

大鼠脑膜细胞(MC)原代细胞

Primary Rat Meningeal Cells (MC)

5X10^5

2周

CSI047Rb01

兔脑膜细胞(MC)原代细胞

Primary Rabbit Meningeal Cells (MC)

5X10^5

2周