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颅缝早闭是不同部位的颅缝过早闭合，影响头颅和脑的正常发育，在新生儿中的发病率为0.25‰。目前，颅缝闭锁的主要治疗方法是复杂的颅骨手术，经常导致年轻患者大量失血。2023年10月，《Cell Stem Cell》杂志上发表了一篇题为“Skull progenitor cell-driven meningeal lymphatic restoration improves neurocognitive functions in craniosynostosis”的文章，在这项研究中，研究者发现 颅骨祖细胞（skull progenitor cells，SPCs）分泌的血管内皮生长因子c（VEGF-C）能促进淋巴内皮细胞（LECs）的生长和迁移，用于激活脑淋巴功能，作为颅缝早闭疾病和神经认知缺陷的治疗策略。

研究者对成年小鼠头部用有机溶剂透明化器官（uDISCO）处理后进行三维成像（3D），成像显示突变小鼠中Prox1⁺脑膜淋巴管密度降低。接着用淋巴管内皮受体1（LYVE1）结合Prox1- eGFP小鼠基因特异性标记淋巴管，免疫染色结果证实Twist1^+/-颅缝早闭小鼠（MUT）脑膜淋巴覆盖率显著降低。研究人员注射Alexa Fluor 647偶联卵清蛋白（OVA-647）后使其流至颈深淋巴结（dCLNs），2h后测量小鼠dCLNs中该示踪剂的情况，在MUT小鼠dCLNs切片中OVA-647的含量明显减少。以及MUT小鼠注射 OVA-647后连续取脑切片，检测脑脊液流入情况，研究人员发现MUT中OVA-647的面积分数显著降低，表明突变小鼠脑脊液大分子通过血管旁通路的脑内流受到影响。研究者将淀粉样蛋白- β42- 488（Ab42-488）和OVA-647示踪剂注射到纹状体（CPu）中，注射1 h后采集全脑标本，进行脑序列切片分析，发现MUT小鼠脑实质中保留了大量的Ab42-488和OVA-647，表明MUT小鼠脑膜淋巴血管破裂导致脑实质组织液（ISF）大分子外排受损。这些结果表明，脑缝闭锁小鼠的脑膜淋巴管受损与脑脊液内流和ISF外排缺陷相关。（见图1）

研究者在MUT小鼠头部双侧植入与可生物降解材料结合的Gli1⁺ SPCs。这种缝线再生手术释放了MUT小鼠的颅内高压，采用再生缝线的Twist1^+/-小鼠（简称REG）的ICP显著降低。结果表明SPC植入可以降低突变小鼠升高的ICP。通过LYVE1全脑膜染色显示，在SPC植入后3个月，REG小鼠的淋巴管覆盖恢复。与MUT小鼠相比，REG小鼠dCLNs中检测到OVA-647 脑脊液示踪剂的含量增加。同时，REG小鼠脑脊液中OVA-647灌注到脑实质的量与WT对照组相当。Gli1⁺ SPC植入后，MUT小鼠ISF外排恢复，脑组织中Aβ₄₂-488和OVA-647残留量明显减少。因此，在Twist1^+/-小鼠中植入Gli1⁺ SPC可降低ICP和脑膜淋巴缺陷。（见图2）

通过细胞实验研究者发现SPC-CM（SPC-培养基）可促进LECs细胞增殖和迁移。免疫染色结果表明VEGF-C在颅缝合线和脑膜硬脑膜的Gli1⁺ SPCs中高度表达。接着对Prox1-eGFP小鼠进行了体外注射VEGF-C，发现VEGF-C在体内促进脑膜淋巴管细胞增殖，LYVE1和Prox1-eGFP标记的EdU⁺和Ki67⁺的显著增加。ELISA结果发现与对照组相比，在SPC-CM中检测到VEGF-C的浓度急剧增加，这表明VEGF-C可以由SPC分泌。WB结果显示经SPC-CM处理的LECs中VEGF-C的主要受体VEGFR3的表达量显著增加。另外，SPC-CM处理也显著增加下游信号分子的表达量。这些结果表明，SPCs分泌VEGF-C，然后激活相邻LECs中的VEGFR3信号，促进细胞增殖和迁移。（见图3）

脑膜硬脑膜共标记染色结果进一步证实脑膜淋巴管附近的Gli1⁺ SPCs表达高水平的VEGF-C。ELISA结果显示与对照组相比MUT小鼠脑膜中VEGF-C的浓度显著降低。研究人员将AAV1-mVEGF-C（腺相关病毒血清型1 -mVEGF-C）或AAV1-GFP对照病毒注射到MUT和对照WT小鼠的脑脊液中，让病毒在脑膜中扩散并完全表达VEGF-C 1个月。用AAV1- VEGF-C处理的MUT小鼠，与对照组相比，VEGF-C处理增加了脑膜淋巴血管的生长，并改善了其功能。在VEGF-C过表达组中，更多的OVA-647 脑脊液示踪剂引流到dCLNs。这些结果表明VEGF-C促进脑缝早闭小鼠的脑膜淋巴血管生长及其引流功能。（见图4）

由前面的实验，研究者发现AAV1-VEGF-C处理改善了MUT小鼠脑脊液内流缺陷和ISF外排缺陷。接下来，研究者对WT和MUT小鼠注射AAV1-eGFP或AAV1-VEGF-C 1个月后，进行行为分析。三箱社交实验结果表明，与对照组相比，AAV1-VEGF-C处理显著改善了MUT小鼠的社交能力和社会记忆缺陷。新事物实验表明，AAV1-VEGF-C处理恢复了MUT小鼠海马依赖性空间识别缺陷。Rotarod法监测运动学习行为，AAV1-VEGF-C处理减轻并几乎完全改善了小鼠的运动学习缺陷。综上所述，这些结果表明，通过VEGF-C处理激活脑膜淋巴血管，可以有效地改善Twist1^+/-颅缝早闭小鼠的脑液稳态缺陷和神经认知异常。（见图5）

总的来说，这些发现说明VEGF-C在脑膜淋巴的发育和体内平衡中起着至关重要的作用，通过SPC植入或VEGF-C基因治疗促进脑膜淋巴功能恢复，是治疗颅缝早闭的一种有效策略。

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