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心脏再生一直以来都是心血管疾病研究领域的重点和前沿。动物出生后，心肌细胞的能量代谢就从糖酵解转变为氧化代谢。与此同时，大多数心肌细胞发生染色质重构和退出细胞周期。这就阻止了心肌细胞分裂，为成人心脏再生形成了一种天然的屏障。近期，德国马克斯·普朗克心肺研究所研究人员在《Nature》上发表了题为“Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice”的研究探索了代谢重编程在克服心脏再生障碍中的作用。研究发现，阻断脂肪酸氧化能提高心肌细胞对缺氧的抵抗力，刺激心肌细胞增殖，使缺血-再灌注损伤后的心脏再生。

研究人员首先对成年小鼠的心肌细胞（cardiomyocytes，CMs）进行了RNA测序（RNA-seq），数据分析显示，在出生后第一周CMs成熟过程中，糖酵解和细胞周期进展相关的几个关键基因的表达水平降低，而与脂肪酸氧化（FAO）和三羧酸循环（TAC）相关的基因发生了上调。上调的FAO相关基因包括肉毒碱棕榈酰转移酶（Cpt1b）的肌肉特异性亚型，但不包括普遍表达的Cpt1b亚型，而这一普遍表达亚型是线粒体摄取脂肪酸以及随后的FAO所必需的。

为了探索FAO在CMs成熟和增殖中的潜在作用，研究人员构建了Cpt1b敲除（Cpt1b^cKO）小鼠模型。观察发现，与对照小鼠相比，Cpt1b^cKO小鼠的体重（BW）、心脏重量（HW）、HW/BW比值和心脏形态均未发生变化。然而，由于心肌的同心生长模式，10周龄Cpt1b^cKO小鼠的心脏大小、HW和HW/BW比都增加。而且Cpt1b^cKO小鼠心脏中CMs的绝对数量增加了一倍。此外，Cpt1b^cKO小鼠的CM表面积相对适度增加，这表明心肌同时发生增生性和肥厚性生长。形态学评价显示，最小CMs（<100μm²）群体显著增加，表明Cpt1b失活后会形成新的CMs，中等大小CMs（100~300 μm²）的比例下降，而较大CMs（＞300μm²）的数量显著增加，反映了CMs表面积的总体增加。这些数据表明，Cpt1b的缺失会刺激CMs的增殖，而CMs增殖通常在出生一周内在小鼠心脏中终止。

图1. Cpt1b失活诱导CMs增生和肥厚生长 

（图片源自《Nature》）

为了研究Cpt1b失活和随后的CMs增殖是否能够促进心脏再生，研究人员对Cpt1b^cKO小鼠进行了缺血-再灌注（I–R）损伤模型构建，该模型与人类冠状动脉阻塞患者进行支架重建的情况非常相似。结果发现，与对照动物相比，3周后，Cpt1b^cKO小鼠几乎没有I-R诱导的疤痕，尽管在I-R手术后24h两个突变心脏的风险区域（AAR）相似。这表明，阻断FAO获得的增殖潜力允许先前存在的CMs重新进入细胞周期并有助于心脏再生。同时，研究者检测到Cpt1b^cKO小鼠在I-R损伤24h后，AAR内梗死面积减少，而在I-R损伤48h后，Cpt1b^cKO小鼠心脏收缩变强，这表明抑制FAO也可以保护小鼠免受I-R损伤。组织学分析显示，与对照组相比，Cpt1b^cKO小鼠的纤维瘢痕面积明显减少。他们还观察到I-R手术后4周，心脏功能的恢复程度几乎达到了损伤前的水平，这明确地证明了cpt1b失活促进了心脏再生。CM增殖和心脏保护增强有助于减少FAO缺乏小鼠冠状动脉闭塞后的疤痕形成。

图2. cpt1b介导的FAO阻断可防止I-R损伤并使心脏再生

（图片源自《Nature》）

接下来，作者探究了FAO的阻断如何重新编程CMs代谢。代谢通量和海马实验表明，长链脂肪酸的利用在Cpt1b^cKO 的CMs中被有效抑制，没有观察到cpt1无关的中链或短链脂肪酸的明显代偿性使用。此外，靶向代谢组学分析显示，来自中链和长链脂肪酸的酰基肉毒碱水平在Cpt1b缺陷的CMs中显著降低，而细胞内游离肉毒碱水平显著升高。出乎意料的是，细胞内乙酰辅酶A水平和TAC的大多数代谢产物没有显著改变，这表明在缺乏FAO的情况下，CMs会通过不同形式产能量。

随后，作者对另一个潜在的能量来源氨基酸进行了检测。发现与氨基酸转化有关代谢物的显著富集，几种参与TAC的氨基酸中间体表达水平也显著增加。同样，作者发现在Cpt1b缺陷的CMs中，支链氨基酸（BCAA）分解代谢的代谢物水平显著升高。因此，作者推断Cpt1b缺陷的CMs中葡萄糖氧化和BCAA分解代谢的增强有效地补偿了脂肪酸衍生的乙酰辅酶A进入三羧酸循环的代谢通量受损。

值得注意的是，Cpt1b失活后，CMs中α酮戊二酸（αKG）显著增加了近20倍。因为谷氨酰胺和谷氨酸的浓度都没有下降，谷氨酰胺和谷氨酸直接转化为αKG似乎不能解释αKG的积累。相反，他们观察到异柠檬酸水平显著降低，同时催化异柠檬酸转化为αKG的异柠檬酸脱氢酶IDH1、IDH2和IDH3A水平升高。此外，在Cpt1b缺失的CMs中，将αKG脱氢酶复合物转化为琥珀酰辅酶a的关键组分OGDH的酶活性有所降低。说明Cpt1b和αKG积累的失活不影响其他三羧酸循环的蛋白水平。上述结果表明，在阻断FAO后，合成水平的提高和代谢水平的降低协同作用使αKG在CMs中积累。

图3. 线粒体脂肪酸输入受阻引起CMs代谢发生改变和αKG水平升高

（图片源自《Nature》）

由于αKG是组蛋白去甲基化酶的重要辅因子。因此，研究人员接着探究了Cpt1b缺陷CMs中αKG的积累是否影响组蛋白甲基化。通过荧光激活细胞分选（FACS）对细胞核进行不同组蛋白赖氨酸甲基化修饰的分析显示，只有H3K4me3水平降低，而其他11种组蛋白赖氨酸甲基化修饰的水平没有降低。而在Cpt1b失活后，异染色质标记物如H3K9me3、H3K27me3和H4K20me2的水平显著增加，这可能是由于CMs向未成熟状态转变带来的次级效应。因此，作者得出结论，αKG增强了H3K4me3特异性去甲基化酶的活性，最终导致H3K4me3水平的降低。

使用FACS分选的CM核对H3K4me3进行染色质免疫沉淀测序（Chip-seq）分析以定位H3K4me3调控变化的基因区域，发现在与CM成熟相关的基因的启动子和基因区域，H3K4me3富集程度普遍降低，而启动子处的H3K9me3和H3K27me3水平保持不变。这些发现表明，αKG的积累激活了H3K4me3特异性去甲基化酶，使其在心脏分化和成熟所需的基因内清除H3K4me3，从而将Cpt1b缺陷型CM向更不成熟的、具有增殖能力的状态进行转变。

图4. αKG表达量升高诱导H3K4me3去甲基化从而降低CM成熟基因表达水平

（图片源自《Nature》）

为了证实αKG的积累是阻止CM成熟和促进增殖的关键信号，研究人员用细胞渗透性αKG处理P0-1新生小鼠的CMs 4天。观察到在胎儿新生阶段表达的基因水平显著升高，而与CM成熟和分化相关的基因水平降低。另外，用αKG处理也能降低H3K4me3修饰水平，但不影响H3K9和H4K20甲基化。用CPI-455 （αKG依赖性H3K4去甲基化酶KDM5的特异性抑制剂）或细胞渗透性R2HG （αKG29的竞争性抑制剂）治疗新生儿CMs，可阻止αKG诱导的细胞周期活性增强或异柠檬酸脱氢酶Idh3b或Idh3g的过表达。KDM5抑制剂CPI-455对αKG依赖性的药理学抑制表明，αKG对染色质和基因表达的影响是由 KDM5基因家族成员传递的。Kdm5b过表达证实了这一假设，当与αKG联合处理时，Kdm5b可显著降低H3K4me3水平，并显著增加CM细胞周期活性。Kdm5b敲低能有效拮抗αKG的促增殖作用，并能完全恢复αKG处理后降低的H3K4me3水平，从而使与CM成熟相关的几个关键基因的表达量上升。

图5. αKG积累会激活KDM5从而减缓CMs的成熟并促进CMs增殖 

（图片源自《Nature》）

总的来说，该研究通过对细胞能量代谢的重编程来重启CMs分裂能力，这一发现具有开创性意义，可能为心肌疾病提供全新的疗法。

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