先天免疫的双重调节因子——SMARCAL1
2024年1月，哥伦比亚大学欧文医学中心在《Cell》杂志发表题名为“SMARCAL1 is a dual regulator of innate immune signaling and PD-L1 expression that promotes tumor immune evasion”的文章，揭示SMARCAL1在肿瘤细胞中发挥的双重作用，这可能是影响免疫检查点抑制剂疗效的关键因素。
DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）和染色质调节在维持基因组稳定性和控制基因表达方面发挥重要作用。近来有些关于肿瘤的研究表明，上调其DDR或染色质调节因子可以诱导固有免疫信号来增强抗肿瘤免疫反应。基于这一猜想，研究人员使用人三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-436），构建了基于荧光激活细胞分选的CRISPR-Cas9筛选方法。根据sgRNA的多重比较分析结果，研究人员筛选到PD-L1、IRF3、CTCF、RAD21、SMARCAL1、SMC3等一系列靶标（见图1）。
图1. 在乳腺癌细胞系中进行的基于FACS的CRISPR-Cas9基因筛选
（图片来自《Cell》杂志）
SMARCAL1是参与DNA复制与修复过程的酶，在细胞面对复制压力时有助于保持基因组稳定性，还能调节基因转录水平。为了验证SMARCAL1基因缺失对PD-L1和IRF3表达水平的影响，研究人员构建了敲除SMARCAL1基因（SMARCAL1-KO）的MDA-MB-436细胞系。免疫印记和流式细胞检测结果显示，SMARCAL1-KO的MDA-MB-43细胞PD-L1蛋白表达水平降低，IRF3磷酸化水平上调。这些结果表明SMARCAL1缺失下调PD-L1表达水平的的同时还能诱导PD-L1的活化。为了评估SMARCAL1基因缺失对免疫功能的影响，研究人员使用PLATE-seq和VIPER算法对SMARCAL1-KO的细胞进行分析，发现细胞周期控制通路下调，IFN依赖信号途径和细胞固有免疫信号上调。另外，SMARCAL1-KO细胞IFNA、IFNB1、CXCL10、SAMD9等基因的转录水平降低，STAT1磷酸化水平增加，CXCL1、CSF-3、CD54、IL1a、IL1b、IL6、IL8、IL32a、MIF、SERPINE1等蛋白的表达水平上调。SMARCAL1突变可致人schimke免疫骨发育不全（SIOD）。研究人员在来自SIOD患者的成纤维细胞和SMARCAL1-KO的小鼠胚胎成纤维细胞上观察到干扰素和干扰素刺激基因的表达上调，这说明SMARCAL1缺失可以在人和小鼠细胞中诱导细胞固有的先天免疫信号传导。进一步基因表达分析显示，由于CD274基因的转录水平降低，从而导致PD-L1蛋白的表达水平下调。这种现象不仅发生在乳腺癌细胞系，前列腺癌细胞系（PC3）、卵巢癌细胞系（PEO1）和骨肉瘤细胞系（U2OS）等细胞系也观察到相同的情况（见图2）。上述研究结果提示，SMARCAL1缺失导致的PD-L1蛋白表达水平下调可在多种人类肿瘤细胞中发生，同时这种情况的发生不依赖于IFN途径。
图2. SMARCAL1缺失时PD-L1表达水平和肿瘤先天免疫分析
（图片来自《Cell》杂志）
考虑到SMARCAL1基因在维持基因组稳定性方面的作用，研究人员猜想SMARCAL1基因缺失肿瘤细胞内的信号传导变化可能和基因组的不稳定性有关。研究人员在SMARCAL1-KO细胞上观察到DNA自发断裂增加，gH2AX病灶和微核增加。更重要的是，SMARCAL1缺失增加了细胞内的cGAMP水平。cGAMP是一种由cGAS合成的环状二核苷酸，可激活STING和IRF3介导的转录。使用细胞周期酶抑制剂处理SMARCAL1-KO肿瘤细胞后，微核形成减少，IL6、CXCL10等细胞因子的表达水平降低。SMARCAL1-KO肿瘤细胞中cGAS微核阳性细胞比例增加。在肿瘤细胞中，微核形成或细胞质DNA积累可激活cGAS-STING通路。此外，SMARCAL1缺失还增强了cGAS合成的2′3′-cGAMP水平，激活了STING和IRF3介导的转录。cGAS或STING的缺失会降低SMARCAL1缺陷细胞中的免疫基因表达。以上结果表明，SMARCAL1缺失导致的细胞内在免疫信号的上调是依赖于cGAS-STING信号途径实现的。
图3. SMARCAL1缺失细胞的内部免疫信号分析
（图片来自《Cell》杂志）
为了了解SMARCAL1是如何对PD-L1蛋白的表达产生影响的，研究人员首先监测了DNA损伤治疗后的SMARCAL1蛋白表达水平。和预期的一样，DNA损伤增加了野生型和SMARCAL1-KO细胞的PD-L1蛋白的表达水平，这提示SMARCAL1缺失下调PD-L1的表达不是依赖于DNA损伤实现的。考虑到SMARCAL1在重塑细胞复制中的作用，研究人员对影响细胞复制重塑因子（ZRANB3和HLTF）也进行了检测，验证他们的缺失是否也能促进PD-L1的表达，然而得到了否定的结果。接下来，研究人员对SMARCAL1基因进行CUT&RUN检测，发现SMARCAL1基因所在的染色质区域富含第4赖氨酸的甲基化组蛋白H3（H3K4me3）。H3K4me3是表观遗传学的生物标志物，通常在基因的启动子附近富集，并且与基因的转录相关，其水平可以反映转录的程度。最后研究人员对SMARCAL1和PD-L1基因的转录起始位点分析，发现SMARCAL1通过直接转录控制PD-L1的表达水平（图4）。
图4. SMARCAL1蛋白对PD-L1蛋白表达水平的调控
（图片来自《Cell》杂志）
为了明确SMARCAL1基因缺失对抗肿瘤免疫反应的影响，研究人员使用黑色素瘤细胞皮下接种C57小鼠进行实验。和对照组相比，SMARCAL1缺失显著抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。重要的是，这种影响是由于细胞抗肿瘤免疫的增强，而非细胞生长受损。流式细胞术结果显示，SMARCAL1-KO肿瘤内的CD45+、CD8+、CD4+阳性细胞的数量增加。在使用CD8抗体治疗后，注射SMARCAL1-KO细胞系的小鼠肿瘤体积显著缩小，生存时间延长（表5）。这些研究表明，SMARCAL1缺失可增强肿瘤免疫原性和细胞毒性T细胞介导的肿瘤排斥反应。
图5. SMARCAL1缺失肿瘤细胞的免疫应答分析
（图片来自《Cell》杂志）
综上所述，SMARCAL1基因不仅可以直接从转录水平促进肿瘤细胞PD-L1基因的表达，帮助其实现免疫逃避，也能限制内源性DNA损伤，从而抑制癌症细胞生长过程中的cGAS-TING依赖性信号传导，达到增强先天免疫及免疫细胞对肿瘤的浸润的目的。这些研究表明，SMARCAL1可能作为癌症免疫治疗的潜在的靶点。
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