实验操作指南-免疫组织化学常见问题和解决方法
查看详情免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性和分子生物技术的敏感性等巧妙结合，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），是单一的静止的形态学描述，上升到结构、功能和代谢为一体的动态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。然而，要想得到一张高质......
多克隆抗体的详细制备方法
查看详情多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）是指用含有多个抗原决定簇的抗原免疫动物后刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体，得到的免疫血清含有多种抗体。多克隆抗体可应用于WB、IHC、Elisa、IP等实验中，是生物医学研究领域不可或缺的研究伙伴。下面我们会来介绍一下多克隆抗体的制备过程。1.免疫原的制备普通的大分子蛋白，通过分子克隆构建载体并在大肠杆菌中进行诱导表达获得重组蛋白，纯化鉴定后可直接作为免疫原。小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶联载体对该分子进行改造才能使其成为具有免疫原性的抗原......
竞争抑制ELISA检测原理
查看详情竞争抑制ELISA法是指将特异性抗体吸附于固相载体，随后加入待测抗原（标准品和样本）和一定量的生物素标记的抗原（检测液A），使二者竞争与固 相抗体结合，温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入HRP标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。由于生物大分......
大肠杆菌重组蛋白纯化方法
查看详情分子克隆构建载体的最终目的是能够将目的蛋白表达出来，常见的表达系 统有大肠杆菌表达系统，酵母表达系统，昆虫细胞表达系统，植物表达系统以 及哺乳动物细胞表达系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简单、 产量高、价格低等优点，是最常用的蛋白表达系统之一。重组蛋白的分离纯化 是蛋白，抗体，Elisa 试剂盒研发与制备的基础。常见的纯化方法有离子交换层 析，亲和层析，疏水作用层析，排阻层析，电泳等，但纯化工作不仅要保证纯 度，重复性，还要保证稳定性并控制成本。以下将以 E.coli 表达的重组蛋白为例， 给大家......
双抗夹心法ELISA检测原理
查看详情双抗夹心 ELISA 法是指将特异性针对待测抗原的抗体包被于 96 孔微孔板 中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中待测抗原与连接于 固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的针对待测抗原的抗体，形成夹心， 将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加 入 TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下 转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测抗原呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(O.D.值)，用于样本中待测抗原浓度测算。原理图如下：
ELISA法检测细胞凋亡的优势
查看详情细胞凋亡，亦称细胞程序性死亡，是细胞在一系列内源性基因的调控下发 生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形 式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区 别开来。传统的检测细胞凋亡的方法有很多种，主要包括：1. 细胞凋亡的形态学检测，包括直接用光学显微镜、倒置显微镜、荧光显 微镜、共聚焦激光扫描显微镜或透射电子显微镜等观察是否有凋亡小体；2. 磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV 法），包括用标记了的 Annexin-V 作 为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜来......
Elisa常见样本的处理方法（二）
查看详情Elisa 是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于 Elisa 实验的成功有着举足轻重的作用。样本收集的时间、处理方法和保存都会 影响到 Elisa 实验的结果。上节我们介绍了血液（血清、血浆），组织匀浆、细 胞裂解液、细胞培养上清等常见样本的处理方法，这一节我们将会介绍皮肤组 织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴 道分泌物等特殊样本的处理方法，供研究者参考。1、痰液1）选择痰液中较为粘稠部分称重，加两倍于痰量的 0.1% DTT(二硫苏糖醇)， DTT 的主要作用是溶解粘液，......
云克隆的改良式酵母表达系统
查看详情众所周知，在基因工程领域，常用的表达系统共有三种，包括：原核表达系统 (大肠杆菌 E. coli 表达系统)、酵母表达系统(P. Pichia 表达系统)和哺乳动物细胞表 达系统。原核表达系统由于操作简单、成本低廉、表达效率高等优点，被广泛应用 于外源基因的蛋白表达。但同时，原核表达体系也有一些自身的缺点，比如容易形 成包涵体，不能进行翻译后加工等等。为了尽量避免原核表达系统自身的不足，Cloud-Clone Corp.又另外开发建立了 酵母表达平台。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质 具有一定程度上的折叠加工......