• CCK-8法细胞活性及细胞增殖检测实验流程

    一 实验材料及试剂96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微量移液器、酶标仪、CCK-8试剂盒等。二 实验步骤1.取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液,每孔100ul加入96孔细胞培养板中。通常细胞增殖实验每孔加入2×103个/100ul 细胞,细胞毒性实验每孔加入5×103个细胞/100ul (具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。如果是贴壁细胞,需要37℃培养箱进行预培养2-4小时等细胞贴壁后再开展实验,如果是悬浮细胞,不需要预培养。2.根据实验需求,在培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时......

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  • 流式细胞术检测细胞分子实验步骤

    一、流式细胞术检测细胞胞膜分子1.细胞重悬:细胞处理计数后,用细胞洗液(含2% BSA的PBS)重悬细胞,使细胞浓度为1×107/mL;2.对照设置:空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞,使每管细胞数达到1×106/管;3.一抗孵育:空白对照管不加抗体,同型对照管和待测样本管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体(具体使用量参照说明书),充分混匀,至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min,孵育期间每隔10min晃动一下反应管,使细胞和抗体充分反应;4.细胞清洗:加入适量细胞洗液,1000rpm离心5min,弃上清,反复洗涤2次......

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  • 竞争抑制ELISA实验操作流程

    1、酶标板包被抗体流程:1.1按说明书推荐的比例稀释包被抗体,或者设计预实验用倍比稀释的方式稀释包被抗体,酶标孔中加100ul包被抗体包被。酶标板加上覆膜,4℃温育过夜或37℃温育2小时。1.2弃去孔内液体,每孔用350μL的洗涤液洗涤,浸泡1-2分钟。在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。此过程也可采用喷射瓶,多道移液器 或自动洗板机来完成。1.3每孔加入200ul封闭液封闭,37℃温育1.5小时。1.4 弃去孔内液体,甩干,洗板1次,方法同步骤1.2。酶标板包被抗体完成。2、实验流程2.1按说明书推荐的方法稀释成不同浓度的标准品工作液......

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  • 竞争抑制ELISA试剂盒标曲拟合及样本测算方法

    竞争抑制 ELISA ,其主要原理是将标本中的靶分子和一定量的靶分子标记物竞争与酶标板上固相抗体结合。 标本中靶分子量愈多,结合在酶标板上的靶分子标记物愈少,最后的显色也愈浅,也就是说,显色的深浅与样本中靶分子含量成负相关。小分子类激素、小分子药物等 ELISA 测定多用此法。这是因为小分子半抗原或多肽半抗原,缺乏两个以上的抗体结合位点,无法形成双抗体夹心结果,对用竞争抑制法定量检测。如何分析检测数据测算结果呢?在这里为大家推荐一种方法,用EXCEL 软件即可完成结果测算。1、标准曲线拟合方法以云克隆公司的去甲......

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  • 免疫细胞化学实验

    免疫细胞化学实验步骤1. 样本制备包括阳性和阴性对照样本制备(含细胞培养、细胞刺激、动物模型等);其中样本的制备要根据实验需要选择新鲜,完整的材料,并且取材后应立即固定,这是制片关键的一步;2. 抗原或抗体的标记(选择特异性高的抗体,每种抗体要经过预实验确定最适浓度后进行正式实验);3. 细胞结构和细胞器的特殊染色;4. 封片镜下观察。结果展示(一)细胞形态观察鬼笔环肽染色细胞骨架,绿色为微丝结构(二)细胞自噬观察荧光自噬双标病毒感染细胞红色斑点是自噬溶酶体(mRFP),黄色斑点是自噬体(RFP+GFP)

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  • 蛋白活性实验-SCF活性蛋白

    蛋白活性实验-SCF活性蛋白干细胞因子(SCF),也称为肥大细胞生长因子(MGF)和铁因子(SLF),在造血、精子和黑色素生成中起着重要作用。SCF已被证明可以刺激TF-1细胞的增殖。实验方法:测试这种效果,将TF-1细胞被接种在96 孔板上,密度1 x 104细胞/孔,重复3孔。在不同浓度SCF中37°C孵育72 h,检测不同浓度的SCF。在倒置显微镜下观察细胞的生长,细胞计数以细胞计数(CCK-8)测定细胞增殖。简要来说,每孔添加10µl CCK-8,于37°C孵育1 - 4小时,然后在450 nm处测量吸光度。实验结果:用倒置显微镜观察添加SCF孵育72h后,TF-1细胞的细胞增......

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  • 蛋白活性实验-TNF-a活性蛋白

    蛋白活性实验-TNF-a活性蛋白TNF-a是内源性的热原,能够引起发热、凋亡细胞死亡、炎症和抑制肿瘤发生。据报道,TNF-a可以抑制A549细胞的增殖和诱导凋亡,在刺激后细胞上清液中IL-1的浓度会增加。实验方法:因此,A549细胞在DMEM孵化TNFa(1 ng / mL,10 ng / mL)2 h,4 h,8 h,24小时、48小时,然后细胞被倒置显微镜观察,IL-1β被ELISA检测细胞上清液中。实验结果:用TNF-a (10ng/mL)孵育72h后观察细胞凋亡(见图一)。A BFigure 1. Effect of TNF-aon A549 cells.(A)A549 cells cultured in DMEM, stimulated with 10ng/mL TNF-afor 72h; (B......

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  • 蛋白活性实验-CD14活性蛋白

    蛋白活性实验-CD14活性蛋白CD14作为一种共受体(连同toll样受体TLR 4和MD-2)用于检测细菌脂多糖(LPS)。CD14只能在脂多糖结合蛋白(LBP)存在的情况下结合LPS。虽然LPS被认为是其主要的配体,但CD14也能识别其他的与病原体相关的分子模式,如lipoteichoic acid。此外,脂多糖结合蛋白(LBP)已被鉴定为CD14的中间体,因此进行了ELISA结合检测,以检测重组人CD14和重组人LBP的相互作用。活性实验:用含0.01%的BSA 的PBS (PH7.4)稀释CD14。将100μl样本转移到LBP预包被板中37℃孵育2 h。用抗CD14多抗孵育1小时后用PBST冲洗,,然后吹吸,冲洗3......

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